Иммунофлюоресцентного анализа на микро пневмония


Выявление возбудителя аденовирусной инфекции (Adenovirus), в основе которого лежит обнаружение в биоматериале комплексов антигена аденовируса с меченными флюорохромом антителами.

Синонимы русские

Аденовирусная инфекция.

Синонимы английские

Adenovirus immunofluorescence.

Метод исследования

Иммунофлюоресценция.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Мазок урогенитальный, мазок из носоглотки, мазок с конъюнктивы.

Как правильно подготовиться к исследованию?

Не принимать пищу в течение 2-3 часов до исследования, можно пить чистую негазированную воду.

Общая информация об исследовании

Аденовирусы – это ДНК-содержащие вирусы семейства Adenoviridae, из которых свыше 50 серотипов болезнетворны для человека, наиболее часто заболевания вызывают серотипы 1-8, 11, 35, 37, 40 и 41. Аденовирусы широко распространены и встречаются как в виде единичных случаев, так и в виде эпидемических вспышек. Источник инфекции – больной человек или вирусоноситель, у которых вирусы выделяются до 3-7-го дня болезни с отделяемым верхних дыхательных путей и конъюнктивы и до 3 недель с фекалиями. Путь передачи – воздушно-капельный или пищевой. Инкубационный период в среднем составляет 5-7 дней.


Аденовирусы вызывают развитие острых заболеваний, протекающих с преимущественным поражением органов дыхания, глаз и лимфатических узлов. Наиболее частыми клиническими формами аденовирусной инфекции являются ОРВИ, фарингит, фарингоконъюнктивальная лихорадка, тонзиллит, средний отит и эпидемический кератоконъюнктивит. Возможно поражение органов желудочно-кишечного тракта с аденовирусным гастроэнтеритом (у детей гастроэнтерит обусловлен серотипами 40 и 41). Аденовирусная инфекция может быть причиной инфекционно-аллергических заболеваний, таких как астматический бронхит, ларинготрахеит и др. Обычно болеют дети, особенно младшего возраста, у которых инфекция протекает тяжелее (с бронхиолитами, пневмониями и т. д.).

Аденовирусная инфекция нередко встречается у иммунокомпрометированных лиц (перенесших трансплантацию органов или костного мозга), поражая трансплантированные органы и системы (гепатит при трансплантации печени, геморрагический цистит или паренхиматозное поражение почек при трансплантации почек), однако при генерализации инфекции могут также страдть легкие, кишечник и центральная нервная система. Аденовирусная инфекция часто встречается при СПИДе и чаще всего затрагивает мочеполовой и желудочно-кишечный тракт.


Генерализация инфекции чаще наблюдается у детей и иммунокомпрометированных лиц и может привести даже к летальному исходу; как правило, она обусловлена 3-м, 7-м, 21-м и 30-м серотипами вируса. В некоторых случаях аденовирус может быть причиной острого геморрагического цистита и других заболеваний мочеполовой системы, а серотипы 1, 6, 12 и особенно 7 способны вызывать спорадический энцефалит и менингоэнцефалит (в том числе как осложнения после ОРВИ). У пациентов с гипогаммаглобулинемией может развиваться хронический менингоэнцефалит, обусловленный аденовирусами 7-го, 12-го и 32-го серотипов.

Для диагностики аденовирусной инфекции применяют методы культивирования вируса, определение его антигена или ДНК в тканях или крови, а также серологические методы (4-кратное увеличение титра антитела в парных сыворотках). Наиболее быстрый и высокоспецифичный (до 90  %) способ диагностики аденовирусной инфекции – иммунофлюоресцентная микроскопия. Она основана на непосредственном связывании антигенов аденовируса в биоматериале с меченными флюорохромом антителами с образованием комплексов антиген-антитело и последующей их микроскопии в ультрафиолетовом свете. Под воздействием ультрафиолета флюорохром начинает светиться, что позволяет быстро выявить антиген аденовируса.

Для чего используется исследование?

  • Для выяснения причин аденовирусной инфекции и ее мониторинга.
  • Для контроля за эффективностью лечения аденовирусной инфекции.
  • Для дифференциальной диагностики заболеваний, протекающих со сходными симптомами (наряду с другими тестами).

Когда назначается исследование?

  • При клинических симптомах аденовирусной инфекции, при конъюнктивите, геморрагическом цистите, фарингите.
  • При обследовании контактных лиц (по эпидемиологическим показаниям).

Что означают результаты?

Референсные значения: не обнаружено.

Причины положительного результата:

  • инфицирование аденовирусами.

Причины отрицательного результата:

  • отсутствие аденовирусной инфекции;
  • низкое содержание аденовирусов в исследуемом биоматериале.

Также рекомендуется

  • Общий анализ крови (без лейкоцитарной формулы и СОЭ)
  • Лейкоцитарная формула
  • Общий анализ мочи с микроскопией осадка
  • Enterovirus, РНК [ПЦР]

Кто назначает исследование?

Инфекционист, офтальмолог, пульмонолог, гастроэнтеролог, терапевт, педиатр.

Литература

  1. Кишкун А. А. Иммунологические и серологические исследования в клинической практике.  – М. : «Медицинское информационное агентство», 2006. – 536 с.
  2. Baum S.G. Adenovirus. In: Principles and practice of infectious disease / G.L. Mandell, Bennett J.E., Dolin R (Eds) ; 6th ed. – Churchill Livingstone, Philadelphia, PA 2005. – 2701 p.
  3. Chernecky C.C. Laboratory tests and diagnostic procedures / C.C. Chernecky, B.J. Berger; 5th ed. – Saunder Elsevier, 2008. – 1232 pp.

Источник: helix.ru

Р-ция имм.флюоресценции. Прямая: меченные Ат наносят на мазок и после промываются. Остаются лишь Ат-Аг, которые светятся в микроскопе.Меченая флюрохромная дифгностическая антисыворотка. Непрямой: используют немеченую диагностическую сыворотку, а присоеденения к антигену выявляют с помощью меченой антиглобулиновой сыворотки,выявляющий ИГ немеченой диогностической сыворотки,присоединившийся к искомому антигену. Для экспресс-диаг.

Иммунофлюоресцентный метод (РИФ, реакция иммунофлюоресценции, реакция Кунса) — метод выявления специфических Аг с помощью Ат, конъюгированных с флюорохромом. Обладает высокой чувствительностью и специфичностью.

Применяется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний (идентификация возбудителя в исследуемом материале), а также для определения Ат и поверхностных рецепторов и маркеров лейкоцитов (иммунофенотипирование) и др. клеток.

Обнаружение бактериальных и вирусных антигенов в инфек­ционных материалах, тканях животных и культурах клеток при помощи флюоресцирующих антител (сывороток) получило широкое применение в диагностической практике. Приготовление флюоресцирующих сывороток основано на спо­собности некоторых флюорохромов (например, изотиоцианата флюоресцеина) вступать в химическую связь с сывороточными белками, не нарушая их иммунологической специфичности.


Различают три разновидности метода: прямой, непрямой, с комплементом. Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета.
Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген — антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.


Механизм. На предметном стекле готовят мазок из исследуемого ма­териала, фиксируют на пламени и обрабатывают иммунной кроличьей сывороткой, содержащей антитела против антигенов возбудителя. Для образования комплекса антиген — антитело препарат помещают во влажную камеру и инкубируют при 37 °С в течение 15 мин, после чего тщательно промывают изото­ническим раствором хлорида натрия для удаления не связавших­ся с антигеном антител. Затем на препарат наносят флюоресци­рующую антиглобулиновую сыворотку против глобулинов кро­лика, выдерживают в течение 15 мин при 37 °С, а затем препарат тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия. В результате связывания флюоресцирующей антиглобулиновой сыворотки с фиксированными на антигене специфическими анти телами образуются светящиеся комплексы антиген — антитело, которые обнаруживаются при люминесцентной микроскопии.

Иммунофлюоресцентного анализа на микро пневмония

36) Иммуноферментный анализ. Компоненты реакции, варианты ее использования в лабораторной диагностики инфекционных заболеваний.

Иммуноферментный анализили метод — выявление ан­тигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бета-галактозидазой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген.


бстрат расщепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции — интен­сивность окраски прямо пропорциональна количеству свя­завшихся молекул антигена и антител. ИФА применяют для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных бо­лезней, в частности для диагностики ВИЧ-инфекций, гепати­та В и др., а также определения гормонов, ферментов, лекар­ственных препаратов и других биологически активных ве­ществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях (1010-1012 г/л).

Твердофазный ИФА— вариант теста, когда один из компо­нентов иммунной реакции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе, напр., в лунках планшеток из полистирола. Компоненты выявляют добавлением меченых антител или анти­генов. При положительном результате изменяется цвет хромоге­на. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты путем промывания,

I. При определении антител (левый рисунок) в лунки планшеток с сорбированным антигеном последовательно добавляют сы­воротку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, ме­ченную ферментом, и субстрат/хромоген для фермента.

Иммунофлюоресцентного анализа на микро пневмония II. При определении антигена (правый рисунок) в лунки с сорби­рованными антителами вносят антиген (напр., сыворотку кро­ви с искомым антигеном), добавляют диагностическую сыво­ротку против него и вторичные антитела (против диагностиче­ской сыворотки), меченные ферментом, а затем субстрат/хро­моген для фермента.


Конкурентный ИФАдля определения антигенов: искомый антиген и меченный ферментом антиген конкурируют друг с другом за связывание ограниченного количества антител иммунной сыворотки.

Другой тест — Конкурентный ИФА для определения антител: искомые анти­тела и меченные ферментом антитела конкурируют друг с дру­гом за антигены, сорбированные на твердой фазе.

Иммуноблоттинг — высокочувстви­тельный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА. Иммуноблоттинг ис­пользуют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др.

Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофоре­за в полиакриламидном геле, затем переносят их из геля на активированную бумагуили нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антиге­нов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся антител боль­ного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов челове­ка, меченную ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс [антиген + антитело больного + антитело против Ig человека] выявляют добавлением хромогенного субстрата, изменяющего окраску под действием фермента.

Источник: studopedia.ru


ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИЯ (лат. immunis свободный, избавленный от чего-либо + флюоресценция) — люминесценция в ультрафиолетовом свете микроскопа биологического объекта, содержащего изучаемый антиген после его предварительной обработки специфическими антителами, меченными флюорохромом.

Метод микроскопии, основанный на явлении (процессе) И., носит название метода Кунса, метода И., метода люминесцирующих антител (сывороток) и применяется в практике как экспресс-метод при микробиол. диагностике инфекционных заболеваний. Его применяют также при изучении патогенеза инфекционных заболеваний, механизма антителогенеза, антигенного анализа биол, объектов.

Иммунофлюоресцентный метод является универсальным иммунохим. методом, сочетающим в себе достаточно точный морфол, анализ со специфичностью и высокой разрешающей способностью иммунол, методов. Он основан на использовании явления люминесценции для выявления реакции антиген — антитело, происходящей на поверхности клеток или на срезах ткани.

Большое преимущество метода И. заключается в его простоте, высокой чувствительности, превосходящей некоторые другие серол, методы, а также в быстроте получения результатов. Можно, вероятно, локализовать и идентифицировать любое вещество, обладающее антигенными (гаптенными) свойствами, независимо от его природы и функции. Кроме того, метод И. вводит в круг исследований нерастворимые антигены тканей, которые недоступны изучению многими иммунол, методами, в частности иммунодиффузионными .


Метод И. был предложен в 1942 г. Кунсом (A. Coons) с соавторами и получил дальнейшее развитие в 50-х гг. после синтеза самого лучшего из существующих флюорохромов — изотиоцианата флюоресцеина (ФИТЦ). В эти же годы в СССР были начаты исследования по использованию этого метода и его совершенствованию.

Успех метода И. во многом зависит от качества люминесцирующих антител (сывороток), которые получают путем хим. реакции между специфическими антителами, содержащимися в иммунной сыворотке, и флюоресцирующим красителем — флюорохромом (см.). Полученный продукт реакции называют конъюгатом. В ряде случаев приготовление специфичных и активных конъюгатов — трудная задача. Обычно с флюоресцирующими красителями конъюгируют не цельные иммунные сыворотки, а фракции сывороточных белков, содержащих антитела. Причем чем лучше очистка от балластных белков, тем более качественный конъюгат можно получить впоследствии. Наилучшие результаты дает использование для метки препаратов чистых антител, но это, к сожалению, не всегда возможно. Качество конъюгата определяется также чистотой и активностью красителя, его количеством при метке, концентрацией белка и антител, величиной pH при метке, временем и температурой конъюгации, а также степенью очистки от балластных белков и избытка красителя и наличием гетеро логичных и нормальных антител.

Флюорохромы — это такие красители, которые способны поглощать свет и излучать его через короткий промежуток времени (10-6—10-9 сек.). Интенсивность флюоресценции пропорциональна интенсивности возбуждающего излучения, и при малых концентрациях вещества возможно количественно определить флюоресцирующее вещество на микроскопическом или цитол, препарате.

К флюорохромам, предназначенным для метки специфического белка, предъявляются следующие основные требования: цвет их флюоресценции должен отличаться от аутофлюоресценции объекта и контрастировать с фоном; они должны обладать высокой интенсивностью флюоресценции после присоединения к белку и не должны существенно изменять физ.-хим. и серол, свойства антител.

В практике используют флюорохромы, имеющие желто-зеленую, желтую и красную люминесценцию. Кроме ФИТЦ, применяют сульфохлорид родамина 200В (PCX), сульфофторид родамина 200В (РСФ), тетраметилродамин изотиоцианат (МРИТЦ), дихлортриазиниламинофлюоресцеин (ДХТАФ) и др.

Конъюгация белка с флюорохромом является хим. реакцией, в результате чего образуется новое соединение, в к-ром краситель присоединен к белку ковалентной связью. В реакции участвуют в основном ε-аминогруппы лизина и концевые аминогруппы белковой молекулы.

Метод И. применяется в трех основных модификациях. При прямом методе [Кунс, Каплан (М. Kaplan), 1950] на препарат, содержащий искомый антиген, наносят специфическую люминесцирующую сыворотку (антитело). После реакции препарат промывают и изучают под люминесцентным микроскопом. Преимуществом этого метода является его одноэтапность и использование небольшого количества контролей реакции.

При непрямом методе [Уэллер (Т. Weller), Кунс, 1954] препарат, содержащий искомый антиген, обрабатывают специфической немеченой сывороткой, несвязавшиеся белки отмывают и наносят люминесцирующую сыворотку к глобулинам немеченой сыворотки. В этом случае в качестве антигенов выступают связанные препаратом антитела первой сыворотки — немеченой. Преимуществом данной модификации является большая чувствительность, чем у прямого метода, и возможность использования ограниченного набора люминесцирующих антител.

Непрямой метод с комплементом [Гольдвассер, Шепард (В. Goldwasser, С. Shepard), 1958] является трехэтапным. Этот вариант заключается в использовании меченой антикомплементарной сыворотки, которая присоединяется к комплементу комплекса антиген — антитело. В такой постановке меченая сыворотка оказывается еще более универсальной.

К. А. Лебедевым с соавторами (1971) описана возможность проведения непрямого метода с использованием двух люминесцирующих сывороток (как антител против выявляемого антигена, так и антител против иммуноглобулинов того вида животных, от которых получена первая специфическая сыворотка).

Прямой метод выявления антител с помощью меченого антигена впервые применил Меллорс (В. Mellors) с соавт, в 1959 г. для доказательства присутствия ревматоидного фактора в определенных клетках организма. Этот вариант метода имеет ограниченное применение.

Во всех вариантах Иммунохим, сущность метода остается неизменной: локализация антигена в препарате обнаруживается по специфической флюоресценции в месте реакции антиген — антитело.

Методика приготовления препаратов различна и зависит от типа исследуемого препарата. Изучению подвергают мазки, мазки-отпечатки из органов, срезы органов, культуру ткани и пр. Для каждого антигена применяют свои фиксаторы. Препараты изучают под люминесцентным микроскопом (МЛ-2, МЛД-1, ЛЮМAM-2 и др.).

В связи с тем что в реакции И. участвует много компонентов, оценка надежности и точности результатов является обязательной частью исследования независимо от природы антигена, свойств и характеристики антител. Поэтому проводят контроль иммунол, специфичности наблюдаемого на препарате свечения и последовательно убеждаются в специфичности меченой сыворотки, качестве ее очистки, доказывают иммунол. характер обнаруживаемого свечения, проводят контроль фонового свечения с нормальной сывороткой, убеждаются в отсутствии реакции за счет антител к посторонним веществам и определяют иммунол, специфичность наблюдаемой реакции. Только после этого делают заключение о специфичности наблюдаемой реакции.

С целью повышения специфичности непрямого метода И. при выявлении тканевых антигенов применяют в качестве реактива меченые чистые антитела или конъюгаты с высоким титром антител, адсорбированные предварительно тканевыми порошками либо гомогенатами, не содержащими антигена, родственного специфическому антителу.

При выявлении бактерий, вирусов, риккетсий, простейших пользуются методами контрастирования неспецифического свечения. С этой целью используют бычий (или иной) альбумин, меченный родамином, синьку Эванса, конго красный и некоторые диазокрасители. При использовании метода контрастирования создают люминесцирующий фон, по цвету контрастирующий со специфическим свечением изучаемого объекта.

Возможность определения и дифференцировки искомого антигена в смеси с другими антигенами позволила создать ускоренные диагностические методы выявления возбудителей инфекционных болезней. Метод И. используется для определения локализации и идентификации различных корпускулярных антигенов (простейшие, бактерии, риккетсии, вирусы) в чистых и смешанных культурах (цветн. рис. 1—3), в культуре клеток, в препаратах-отпечатках, срезах органов и тканей, патол, материале от больных. Чувствительность метода при исследовании мазков из взвеси бактерий — в пределах 104—5*104 клеток в 1 мл. Он позволяет обнаружить возбудителей тех инфекций, лабораторная диагностика которых основывается на изучении антигенных свойств возбудителей (вирусные заболевания, риккетсиозы, колиэнтериты). Метод И. эффективен при обнаружении возбудителей (чумы, туляремии, сальмонеллезов и др.) в крови человека, в органах и тканях животных (см. Идентификация вирусов, Идентификация микробов).

Метод И. широко используется в серодиагностике сифилиса и иммунопатологических состояний. При обследовании больных с заболеваниями соединительной ткани он используется для обнаружения антинуклеарных факторов, антикардиальных антител, иммуноглобулиновых рецепторов клетки и для выявления иммунол, факторов в участках поврежденной ткани.

Особый интерес представляет изучение антигенов опухолевых клеток, которые имеют поверхностно локализованные специфические антигены, отсутствующие в нормальных клетках. Изучению опухолевых антигенов, их роли в процессе малигнизации клетки и во взаимоотношениях опухоли и хозяина посвящено много исследований, использующих метод И.

С помощью метода И. проводится также изучение генетических маркеров иммуноглобулинов человека.

См. также Люминесценция.

Библиография: Гольдин Р. Б. и др. Иммунолюминесценция в медицине, М., 1977; Зубжицкий Ю. Н. Метод люминесцентной микроскопии в микробиологии, вирусологии и иммунологии, Л., 1964, библиогр.; Иммунохимический анализ, под ред. Л. А. Зильбера, с. 202, М., 1968; Левина E. Н. и д р. Люминесцирую-щие антитела (в изучении патогенных микроорганизмов), М., 1972, библиогр.; Михайлов И. Ф. и Дьяков С. И. Люминесцентная микроскопия, М., 1961, библиогр.; Goons А. Н. а. о. Demonstration of pneumococcal antigen in tissues by use of fluorescent antibody, J. Immunol., v. 45, p. 159, 1942; G o 1 d m a n M. Fluorescent antibody methods, N. Y.— L., 1968, bibliogr.; Kawamura A. Fluorescent antibody techniques and their applications, Tokyo, 1969; Nairn R.G. Fluorescent protein tracing-, Edinburgh, 1964; Wagner M. Fluoreszierende Anti-korper und ihre Anwendung in der Mikro-biologie, Jena, 1967. Bibliogr.

Источник: xn--90aw5c.xn--c1avg


You May Also Like

About the Author: admind

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Этот сайт использует Akismet для борьбы со спамом. Узнайте, как обрабатываются ваши данные комментариев.