Иммунный блот



Имя ему СПИД Вячеслав Залманович Тарантул

Иммуноблоттинг — дополнительный непрямой метод

Кроме ИФА в определенных случаях для тестирования ВИЧ-инфекции используют процедуру, называемую «иммуноблоттинг» или «иммунный блоттинг» (иногда называют еще «вестерн-блот»). По рекомендации ВОЗ иммуноблотинг используется при диагностике ВИЧ-инфекции в качестве дополнительного экспертного метода, который должен подтверждать результаты ИФА. Обычно этим методом перепроверяют положительный результат при ИФА, поскольку он считается более чувствительным и специфичным, хотя более сложным и дорогим. Но прежде чем подписать окончательный приговор пациенту, врач должен убедиться полностью в правильности диагноза. Поэтому вопрос о сложности и дороговизне здесь не может быть решающим.

Как по назначению, так и по способу исполнения к иммунному блоттингу хорошо подходит известное выражение «вывести на промокашку». Иммунный блоттинг сочетает в себе иммуноферментный анализ (ИФА) с предварительным электрофоретическим разделением белков вируса в геле и их переносом на нитроцеллюлозную мембрану («промокашку»).


оцедура иммуноблота состоит из нескольких стадий (рис. 27). Сначала предварительно очищенный и разрушенный до составных компонентов ВИЧ подвергается электрофорезу, при этом все входящие в состав вируса антигены разделяются по молекулярному весу. Затем методом блоттинга (аналог выдавливания на «промокашку» избытка чернил) антигены переносят из геля на полоску нитроцеллюлозы или нейлонового фильтра, которые отныне содержат невидимый пока глазом спектр белков, характерный для ВИЧ. Далее на стрип наносится исследуемый материал (сыворотка, плазма крови пациента и т. п.), и если в пробе есть специфические антитела, то они связываются со строго соответствующими им полосками белков-антигенов. В результате последующих манипуляций (подобных ИФА) результат этого взаимодействия визуализируется — делается видимым. В конечном итоге наличие полос на определенных участках стрипа подтверждает присутствие в исследованной сыворотке антител к строго определенным антигенам ВИЧ.

Иммунный блоттинг чаще всего используют для подтверждения диагноза ВИЧ-инфекции. ВОЗ считает положительными сыворотки, в которых методом иммунного блотинга обнаруживаются антитела к каким-либо двум белкам оболочки ВИЧ. Согласно этим рекомендациям, при наличии реакции только с одним из белков оболочки (gp160, gp120, gp41) в сочетании или без реакции с другими белками результат считается сомнительным и рекомендуется повторное исследование с использованием набора другой серии или другой фирмы. Для подстраховки, если


Рис. 27. Для проведения иммуноблотинга на первом этапе белки, содержащиеся в сыворотке крови, разделяют в геле по их молекулярной массе и заряду с помощью электрического поля (методом электрофореза в геле). Затем на гель накладывают нитроцеллюлозную или нейлоновую мембрану и «промокают» (это и есть блоттинг). Это осуществляют в специальной камере, которая позволяет осуществить полный пернос материала из геля на мембрану. B результате та картина расположения белков, которая была на геле, воспроизводится на мембране (блот), с которой можно далее легко манипулировать. Первоначально мембрану обрабатывают антителами к искомому антигену, а после отмывки несвязанного материала добавляют радиоактивно меченный коньюгат, который специфически связывается с антителами (как в ИФА). Местоположение образующегося комплекса «антиген-антитело — меченый коньюгат» определяют с помощью авторадиографии с использованием рентгеновской пленки. После ее проявления становится ясным, есть ли антигены в крови или их нет и после этого результат остается сомнительным, рекомендуется последующее наблюдение в течение шести месяцев (исследования продолжаются через каждые три месяца).

B настоящее время в РФ для использования при диагностике ВИЧ-инфекции рекомендовано использовать пять тест-систем, среди которых имеются как российские, так и зарубежные.


Из книги Анестезиология и реаниматология автора Марина Александровна Колесникова

11. Непрямой массаж сердца C–Circulation – обеспечение гемоциркуляции – непрямой массаж сердцаЗакрытый массаж сердца является наиболее простым и оперативным способом экстренного искусственного поддержания кровообращения. К закрытому массажу сердца следует приступать

Из книги Странности нашего тела. Занимательная анатомия автора Стивен Джуан

Какой дополнительный вес я наберу во время беременности и останется ли он после того, как ребенок родится? В среднем, женщина за период беременности набирает 9,9 кг. Она теряет 6,1 кг в течение часа после родов, избавляется от 1,6 кг за следующие 12 дней, а через 6 недель весит на

Из книги Методичка по первой помощи автора Николай Берг

НЕПРЯМОЙ МАССАЖ СЕРДЦА И СЕРДЕЧНО-ЛЕГОЧНАЯ РЕАНИМАЦИЯ В случаях, когда у пострадавшего остановились дыхание и циркуляция крови, необходимо немедленно приступить к сердечно-легочной реанимации, то есть сочетанию искусственной вентиляции легких и непрямого массажа

Из книги Как 100 % бросить курить, или Полюби себя и измени свою жизнь автора Давид Кипнис

Мой метод Я твёрдо решил бросить курить и рассчитывал добиться результата сам, без сложных подготовок и специальных курсов. У меня это получилось. И поверьте — всё оказалось значительно проще, чем я думал.После того, как я перепробовал разные методы бросить курить, я


Из книги Полный справочник по уходу за больными автора Елена Юрьевна Храмова

Непрямой массаж сердца Пострадавшего уложить на спину на жесткую поверхность (пол, асфальт, щит, длинный стол, жесткие носилки), запрокинуть ему голову. Предварительно освободив полость рта, сделать 5 вдуваний воздуха в рот или нос пострадавшего. Затем спасатель должен

Из книги Справочник неотложной помощи автора Елена Юрьевна Храмова

Из книги КЕСАРЕВО СЕЧЕНИЕ: Безопасный выход или угроза будущему? автора Мишель Оден

Дополнительный урок Обзор Банка данных в поисках новых сведений о возможных долгосрочных последствиях рождения кесаревым сечением преподносит нам еще один поучительный урок. Никак нельзя обойти вниманием исследования, из которых следует, что всевозможные осложнения

автора Гэри Гриффин

Из книги Как увеличить размеры мужского полового члена автора Гэри Гриффин

МЕТОД «V» Несколько лет назад у жителя штата Нью-Джерси Юджина Вискионе возникла не поддающаяся лечению болезнь пейрония (аномальное искривление пениса). Такой синдром может возникнуть в любое время и обычно связывается с травмой члена, особенно при половом

Из книги Библия секса автора Пол Джоанидис

Дополнительный материал к этой книге (Откровения наших читателей) Здесь мы разместили ответы на ваши вопросы, которые мы получили от вас по электронной почте на наш сайт в Интернете: www.goofyfootpress.com. Большинство из них вошло в этот материал. (Здесь несколько раз встречается


Из книги Йога-терапия. Новый взгляд на традиционную йога-терапию автора Свами Шивананда

65. Сахаджа-басти-крийя-1Б. Дополнительный вариант Слабые и больные люди могут выпить воду с лимонным соком и солью, как было указано выше, выполнить Сахаджа-випарита-карани, Йога-мудру, Павана-муктасану, Ардха-курмасану и поочередное поднимание ног в Шалабхасане. Действие.

Из книги Соблазнение автора Сергей Огурцов

Метод №4: Шок Этот метод основывается на разрушении ее привычных стереотипов.В этом случае вы говорите с железными интонациями Арнольда Шварценеггера в роли Терминатора:«Непривлекателен? А разве кто-то говорил, что я должен быть привлекателен для тебя? Меня это мало

Из книги Гимнастика для внутренних органов автора Виктория Владимировна Мазовецкая

Глава 7. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ КОМПЛЕКС УПРАЖНЕНИЙ Наше тело все время говорит с нами. Если бы мы только нашли время его послушать! Л.Хей УПРАЖНЕНИЯ ДЛЯ УКРЕПЛЕНИЯ ЖЕНСКИХ ИНТИМНЫХ МЫШЦУпражнения, о которых речь пойдет ниже, предназначены для женщин, так что мужчины могут

Из книги Плоскостопие. Самые эффективные методы лечения автора Александра Васильева

Дополнительный комплекс процедур, применяемых при лечении плоскостопия Остеопатия – это мягкая, щадящая техника, которая направлена прежде всего на восстановление нормальной механики опорно-двигательного аппарата, а также на снятие патологического напряжения,


Из книги Красота и здоровье женщины автора Владислав Геннадьевич Лифляндский

Дополнительный уход Дополнительный уход – это то, что необходимо делать не реже одного раза в неделю. К процедурам дополнительного ухода относятся применение косметических средств по уходу за кожей лица, тела, шеи, декольте; процедуры для ухода за волосами и

Из книги Йога и сексуальные практики автора Ник Дуглас

Дополнительный словарь терминов, используемых для обозначения половых органов Китайские термины Мужской орган Верный Слуга Вершина Радости Вершина Ян Меч Орудие Оружие Любви Оруженосец Парень Посол Птица Малиновка Разбойник Плод Черепаха Яшмовая Флейта Яшмовый

Твердофазный ИФА — вариант теста, когда один из компо­нентов иммунной реакции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе, напр., в лунках планшеток из полистирола. Компоненты выявляют добавлением меченых антител или анти­генов. При положительном результате изменяется цвет хромоге­на. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты путем промывания,

При определении антител (левый рисунок) в лунки планшеток с сорбированным антигеном последовательно добавляют сы­воротку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, ме­ченную ферментом, и субстрат/хромоген для фермента.


II. При определении антигена (правый рисунок) в лунки с сорби­рованными антителами вносят антиген (напр. сыворотку кро­ви с искомым антигеном), добавляют диагностическую сыво­ротку против него и вторичные антитела (против диагностиче­ской сыворотки), меченные ферментом, а затем субстрат/хро­моген для фермента.

Конкурентный ИФА для определения антигенов: искомый антиген и меченный ферментом антиген конкурируют друг с другом за связывание ограниченного количества антител иммунной сыворотки.

Другой тест — конкурентный ИФА для определения антител: искомые анти­тела и меченные ферментом антитела конкурируют друг с дру­гом за антигены, сорбированные на твердой фазе.

Иммуноблоттинг — высокочувстви­тельный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА. Иммуноблоттинг ис­пользуют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др.

Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофоре­за в полиакриламидном геле, затем переносят их из геля на активированную бумагуили нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антиге­нов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся антител боль­ного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов челове­ка, меченную ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс [антиген + антитело больного + антитело против Ig человека] выявляют добавлением хромогенного субстрата, изменяющего окраску под действием фермента.

Источник: blohu.ru

Интерфероны, природа. Способы получения и применения.


Интерферонотносится к важным защитным белкам иммунной системы. Открыт при изучении интерференции вирусов, т. е. явления, когда животные или культуры клеток, инфициро­ванные одним вирусом, становились нечувствительными к заражению другим вирусом. Оказалось, что интерференция обусловлена образующимся при этом белком, обладаю­щим защитным противовирусным свойством. Этот белок назвали интерфероном.

Интерферон представляет собой семейство белков-гликопротеидов, которые синтезируются клетками иммунной системы и соединительной ткани. В зависимости от того, какими клетками синтезируется интерферон, выделяют три типа: α, β и γ-интерфероны.

Альфа-интерферонвырабатывается лейкоцитами, и он получил название лейкоцитарного;бета-интерферонназывают фибробластным, поскольку он синтезируется фибробластами — клетками соединительной ткани, агамма-интерферон — иммунным, так как он вырабатывается активированными Т-лимфоцитами, макрофагами, естественными киллерами, т. е. иммунными клетками.

Интерферон синтезируется в организме постоянно, и его концентрация в крови де­ржится на уровне примерно 2 МЕ/мл (1 международная единица — ME — это количество интерферона, защищающее культуру клеток от 1 ЦПД50вируса). Выработка интерферона резко возрастает при инфицировании вирусами, а также при воздействии индукторов интерферона, например РНК, ДНК, сложных полимеров. Такие индукторы интерферона получили названиеинтерфероногенов.


Помимо противовирусного действия интерферон обладает противоопухолевой защитой, так как задерживает пролиферацию (размножение) опухолевых клеток, а также иммуномодулирующей активностью, стимулируя фагоцитоз, естественные киллеры, регулируя антителообразование В-клетками, активируя экспрессию главного комплекса гистосовместимости.

Механизм действияинтерферона сложен. Интерферон непосредственно на вирус вне клетки не действует, а связывается со специальными рецепторами клеток и оказывает влияние на процесс репродукции вируса внутри клетки на стадии синтеза белков.

Применение интерферона. Действие интерферона тем эффективнее, чем раньше он начинает синтезироваться или поступать в организм извне. Поэтому его используют с профилактической целью при многих вирусных инфекциях, например гриппе, а также с лечебной целью при хронических вирусных инфекциях, таких как парентеральные гепатиты (В, С, D), герпес, рассеянный склероз и др. Интерферон дает положительные результаты при лечении злокачественных опухолей и заболеваний, связанных с иммунодефицитами.

Интерфероны обладают видоспецифичностью, т. е. интерферон человека менее эффективен для животных и наоборот. Однако эта видоспецифичность относительна.


Получение интерферона. Получают интерферон двумя способами: а) путем инфицирования лейкоцитов или лимфоцитов кро­ви человека безопасным вирусом, в результате чего инфицированные клетки синтезируют интерферон, который затем выделяют и конструируют из него препараты интерферона; б) генно-инженерным способом — путем выращивания в производственных условиях рекомбинантных штаммов бактерий, способных продуцировать интерферон. Обычно используют рекомбинантные штаммы псевдомонад, кишечной палочки со встроенными в их ДНК генами интерферона. Интерферон, полученный генно-инженерным способом, носит название рекомбинантного. В нашей стране рекомбинантный интерферон получил официальное название «Реаферон». Производство этого препарата во многом эффективнее и дешевле, чем лейкоцитарного.

Рекомбинантный интерферон нашел широкое применение в медицине как профилактическое и лечебное средство при вирусных инфекциях, новообразованиях и при иммунодефицитах.

Иммунный блоттинг в диагностике ВИЧ

Основы иммунологии — Иммуноблотинг

Cмотрите так же…
Основы иммунологии
Предмет, цели и задачи иммунологии
Общая характеристика иммунной системы млекопитающих
Строение и характеристика центральных и периферических органов иммунной системы
Понятие об иммунитете. Естественный иммунитет. Активная и пассивная формы иммунитета.
Искусственный иммунитет и его роль в борьбе с инфекционными заболеваниями. Понятие о вакцинах и сыворотках, применяемых для профилактики инфекционных болезней
Конститутивные и индуцибельные защитные механизмы организма млекопитающих от инфекции.
Защитная функция кожи и слизистых оболочек млекопит-х.
Роль нормальной микрофлоры человека в защите от инфекции.
Развитие и характеристика фагоцитирующих клеток млекопитающих
Процесс фагоцитоза. Механизмы инактивации микроорганизмов фагоцитами.
Система комплемента, пути ее активации и механизм действия.
Общая характеристика иммунного ответа на тимусзависимые антигены, его этапы и конечный результат.
Развитие и характеристика антигенпредставляющих клеток, их локализация в организме
Процессинг антигена, его значение в развитии иммунного ответа
Т-лимфоциты, их развитие и локализация. Т-хелперы и их роль в развитии иммунного ответа на тимусзависимые антигены
В-лимфоциты, их развитие и локализация. Плазматические клетки и продукция антител
Иммунологическая память. Первичный и вторичный иммунный ответ
Характер взаимодействий антигенпредставляющих клеток
Понятие об антигенах. Общие свойства антигенов. Полные и неполные антигены.
Классификация антигенов по происхождению. Типы антигенной специфичности
Зависимость антигенных свойств от молекулярной структуры.
Классификация антигенов по происхождению. Типы антигенной специфичности
Функции Fаb- и Fс-частей молекулы иммуноглобулина
Генетические механизмы формирования специфичности иммуноглобулинов и переключения клеток на синтез иммуноглобулинов определенного класса
Паратоп и эпитоп. Характер взаимодействия антиген-антитело. Аффинитет и авидность
Агглютинация и преципитация. Реакции агглютинации и преципитации, применяемые в биологии и медицине
Иммуноэлектрофорез, его основные разновидности
Методы иммунофлюоресценции
Иммуноферментный анализ
Иммуноблотинг
реакции с участием комплимента.
Реакции нейтрализации, реакция опсонизации
Анафилаксия, анафилактический шок, сывороточная болезнь. Механизм возникновения гиперчувствительности немедленного типа. Аллергия и аллергены
Гиперчувствительность замедленного типа и механизмы ее развития
All Pages

Page 31 of 35

 Иммуноблотинг

Иммуноблоттинг применяют для выявления антител к отдельным антигенам или «узнавания» антигенов по известным сывороткам. Метод состоит из 3 этапов: разделения биологических макромолекул (например, вируса) на отдельные белки с помощью электрофореза в полиакриламидном геле; переноса разделенных белков из геля на твердую подложку (блот) путем наложения пластины полиакриламидного геля на активированную бумагу или нитроцеллюлозу (электроблоттанг); выявления на подложкеискомых белков с помощью прямой или непрямой иммуноферментной реакции. Как диагностический метод иммуноблоттинг используют при ВИЧ-инфекции. Диагностическую ценность имеет обнаружение антител к одному из белков внешней оболочки вируса.

Иммуноблоттинг

После разделения сложной смеси белков методом электрофореза в полиакриламидном или агарозном геле их можно перенести из геля на микропористую нитроцеллюлозную мембрану. Далее неспецифически связанные с мембраной антигены могут быть идентифицированы с помощью меченых антител. Данный метод получил широкое распространение. Например, он используется для идентификации компонентов нейрофиламентов, которые предварительно разделяют в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН). Разумеется, если антиген необратимо денатурируется ДСН, то такая методика использоваться не может. Если белки антисывороткк разделить изоэлектрофокусированием, а затем перенести (это и называется блоттингом)на мембрану, то с помощью меченого антигена можно установить и так называемый спектротип антисыворотки, т.е. определить изотип антител, взаимодействующих с данным антигеном.

Иммуноблоттинг

Иммуноблоттинг выполняли в три основных этапа: 1) фракционирование образца (см.3.3.), 2) перенос фракций на фильтр (собственно блоттинг), 3) иммунное выявление антигенов на фильтре.

Перенос фракций из геля на фильтр

Белки переносили из геля на фильтр электрофоретическим пометоду Тоубина с модификациями. Использовали нитроцеллюлозные фильтры с диаметром пор 0,2 мкм. Перенос осуществляли в приборе для переноса (BIO-RAD, Швеция) (рис.3.1), следуя протоколу фирмы.

Прибор для переноса белков (BIO-RAD, Швеция).

Рис.3.1.

В состав буфера для переноса входили 0,025 М трис — HCl, рН 8,3, 0,192 М глицин, 20 % метанол. Готовили «сэндвич», состоящий из последовательно уложенных друг на друга 1 листа фильтрованной бумаги, нитроцеллюлозы, гель и 1 листа фильтрованной бумаги. Такой «сэндвич» плотно зажимали между двумя губчатыми прокладками и помещали в камеру для переноса. Перенос проводили при комнатной температуре в режиме стабилизации по напряжению (100 В) в течение 1,5-2 часов.

По окончании переноса фильтр подвергали иммунному окрашиванию.

Иммунное выявление антигенов на фильтре

Иммунное выявление антигенов на фильтре выполняли по методу Тоубина с модификациями. По окончании электропереноса фильтр промывали в РВS (50 мМ трис HCl, рН 7,5, содержащий 150 мМ NaCl) в течение 5 мин, а затем инкубировали в РВS, содержащем 0,05 % Твина — 20 и 2 % сухого обезжиренного молока в течение 1 часа. Эта стадия необходима для блокирования свободных участков мембраны и предотвращения последующей неспецефической сорбции антител на эти участки. Фильтр отмывали 5 минут в Т-РВS (РВS, содержащий 0,05 % Твина — 20), а затем инкубировали с первичными антителами, взятыми в соответствующих разведениях в Т-РВS (1:1000), в течение ночи при 4 С. Затем фильтр отмывали Т-РВS (3 раза по 10 минут) и инкубировали с биотинилированными антимышинными либо антикроличьими JgG, взятыми в разведении 1:1000 в Т-РВS, в течение 1 часа. От несвязавшихся иммуноглобулинов фильтр отмывали 3 раза по 10 минут в Т-РВS, а затем инкубировали с конъюгатом стрептавидин-пероксидаза хрена, взятым в разведении 1:1000 в Т-РВS, в течение 1 часа. По окончании инкубации фильтр отмывали в Т-РВS 5 раз (первые две отмывки были по 15 минут, а три последние по 5 минут).

Мониторинг иммобилизованных антигенов проводили с помощью окрашивания в 10 % растворе диаминобензидина в 0,1% Т-РВS, содержащим 3% Н2О2.

Активация нейтрофилов

Выделенные нейтрофилы ресуспендировали в Hepes/ глюкозном буфере (10 мМ HEPES, рН 7,5, содержащий 150 мМ NaCl, 5 мМ КОН, 1,2 мМ MgCl2, 1,3 мМ CaCl2, 5,5 мМ глюкозы) до концентрации 1-3107 клеток/мл. Клеточную суспензию делили на аликвоты по 500 мкл., которые либо помещали в ледяную баню (для исследования антигенов в покоящихся клетках) либо подвергали воздействию агента, стимулирующего секрецию. В последнем случае клетки преинкубировали в 4-форбол 12-миристат 13-ацетатом, взятым в концентрации 20 мг/мл при 37 С в течение 10 мин., затем активированные и покоящиеся нейтрофилы подвергали процедуре иммунопреципитации.

Иммунопреципитация

В экспериментах по иммунопреципитации покоящиеся и активированные нейтрофилы (107 клеток) лизировали в 500 мкл лизисного буфера (20 мМ Т рис — НСl, рН 7,2, 100 мМ КСl, 0,9 % Тритон Х-100, 10% глицерол, 2 мМ ФМСФ). Лизаты подвергали центрифугированию при 18000 д (20 мин; 4С) и отбирали супернатанты. Супернатанты (в составе которых имеются различные SNARE комплексы) подвергали иммунопреципитации. Антитела против VAMP-1, SNAP-25, SNAP-23 сорбировали на протеин А-агарозе (10-20 мкг антител на 100 мкл 20-%-ой протеин А-агарозы) 2 часа при 4 С. Полученный афинный сорбент отмывали от несвязавшихся антител лизисным буфером, после чего инкубировали с лизатом нейтрофилов в течение носи при 4С. По окончании инкубации агарозу осаждали и 3 раза промывали лизисным буфером, после чего добавляли 30 мкл буфера для приготовления образцов для электрофореза (62,5 мМ Т рис —НСl, рН 6,8, 100 мМ дитиотрейтол, 2% SDS, 10% глицерол и 0,1 %, бромфеноловый синий) 5 и иммуноблотингу с использованием антител против синтаксина 6, а также VAMP-1, SNAP-25 и SNAP-23 (для контроля связывания АТ носителя с соответствующими компонентами SNARE комплексов).

Иммуноблоттинг

Немаловажное свойство этой мембраны — возможность ее многократного использования. Нейлоновые мембраны Zeta-Probe эффективно связывают SDS-белки в отсутствие спирта, причем это связывание устойчиво к последующим обработкам

Низкомолекулярные белки также удерживаются эффективно. Благодаря высокой связывающей емкости — около 480 мкг белка на 1 см2 — мембраны Zeta-Probe позволяют обнаруживать следовые количества белка в анализируемых смесях.

После того как антиген оказывается иммобилизованным на мембране, оставшиеся центры связывания блокируют растворами желатина, либо бычьего сывороточного альбумина, либо обезжиренного молока.

Затем мембрану инкубируют в растворе поликлональных или моноклональных антител к исследуемому анти гену. После отмывки несвязавшихся антител мембрану инкубируют в растворе вторичных антител, которые представляют собой конъюгат ферментов щелочной фосфатазы (alkaline phosphatase, АР) или пероксидазы хрена (horseradish peroxidase, HRP) с антивидовыми антителами (козьи антитела к иммуноглобулинам кролика, мыши или человека) либо белками А (белок Staphylococcus aureus) или G (белок Streptococcus sp.), имеющими высокую аффинность к Fc-области иммуноглобулинов.

Детекцию образованных иммунных комплексов проводят химическим или хемилюминесцентным способом. Субстратами для химической реакции при использовании конъюгатов щелочной фосфатазы служат 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат (BCIP) или тетразолий голубой (NBT), а при использовании конъюгатов пероксидазы хрена — 4-хлор-1-нафтол и перекись водорода.

В результате ферментативных реакций на мембране образуется окрашенная полоса или пятно в месте локализации комплекса антиген-антитело.

Чувствительность данного метода составляет 100 пг белка при использовании конъюгатов АР и 100-500 пг при использовании конъюгатов HRP. Хемилюминесцентная детекция иммунных комплексов позволяет определять менее 5 пг антигена. Принцип этого метода заключается в том, что при реакции HRP с перекисью водорода и циклическим диацилгидразинлюминолом происходит эмиссия света длиной волны 428 нм, которая может быть зафиксирована на светочувствительной пленке.



Реакция иммуноблотинга (РИ) разработана на основе ИФА. Является самым специфичным и чувствительным методом иммунохимического анализа. Иммуноблотинг (от англ. blot – промокать, пятно) сочетает ИФА с электрофорезом. Применяется для выявления не комплексных антител к ВИЧ, а антитела к отдельным его структурным белкам (белки-р24, гликопротеины-gр120, gр 41 и др.). Относятся к экспертным (подтверждающим) реакциям диагностики ВИЧ-инфекции.

Реакция проводится в несколько этапов:

Вирус разрушают на компоненты — антигены (р24, gр120, gр 41 и др.), которые подвергаются электрофорезу в полиакриламидном геле, то есть разделению антигенов на фракции по молекулярной массе.

2. Гель покрывают нитроцеллюлозной мембраной и на неё при помощи электрофореза переносятся фракции антигенов. Нитроцеллюлоза ведёт себя подобно промокательной бумаге. Мембрану разрезают на полоски (стрипы). Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антигенов.

Ложноположительный иммуноблот

Найдено (70 сообщений)

СПИД
25 января 2012 г. / Виктория…

Спидофобам, научная стаття о ВЭБ, можно все симптомы на него списать, у меня даже иммунограмма похожая
http://novosti.mif-ua.com/archive/issue-994/article-1038/print.html открыть (еще 19 сообщений)Последние 5:

25 января 2012 г. / Андрей

… тему нет. Наоборот, антитела к другим инфекциям могут быть восприняты ИФА как антитела к ВИЧ, и, соответственно, результат анализа будет ложноположительный, поэтому и сдают иммуноблот.

СПИД
12 декабря 2011 г. / Анна / Москва

Добрый день, подскажите, может ли быть ложноположительный ИФА если есть миома матки, полипы, и поблема с почкой? И еще вопрос- Ифа может быть сомнительным? а платном медцентре… открыть

13 декабря 2011 г. / Erik Kivexa

Анна, здравствуйте. Как уже сказали, ложноположительный ИФА бывает по разным причинам и … он положительный, то нужно сделать проверочный иммуноблот. Он не может стоить 11 тысяч … Вам обратиться в ваш СПИД-центр и сделать иммуноблот там или сделать тест еще раз …

СПИД
6 декабря 2011 г. / таня

Пожалуйста, помогите мне! 3 недели назад у меня взяли кровь из вены на антитела. Через неделю я пришла забрать результат, а мне ответили, что анализ в работе! и сказали… открыть (еще 8 сообщений)Последние 5:

6 декабря 2011 г. / Аноним

Результат вполне может быть ложноположительный, в таких случаях сделают иммуноблот и по его результатам вынесут окончательный вердикт. А еще, вполне могли в лабе что то напутать, такое тоже бывает .

СПИД
6 ноября 2011 г. / Анастасия… / москва

здравствуйте.скажите пожалуйста может ли анализ на ВИЧ показывать несколько раз подрят (в разных клиниках) ложноположительный анализ? и вообще из-за чего показывает… открыть

6 ноября 2011 г. / Анастасия…

… .я писала что была донором.а что такое первичный ИФА тест?а может быть что ложноположительный анализ опять был и из-за этого отправили в СПИД-центр на перепроверку?и как между собой связаны иммуноблот и первичный ИФА тест?

6 ноября 2011 г. / Erik Kivexa

Анастасия, здравствуйте. Да, вполне может. Ложноположительный результат бывает из-за перекрестных реакций с белками со схожей структурой. Это ничего не значит, если иммуноблот отрицательный, значит ВИЧ в организме нет.

СПИД
25 августа 2011 г. / Сергей / Москва

Здравствуйте! Через какое время после опасного контакта анализ методом ПЦР будет максимально достоверен? Спасибо! открыть

25 августа 2011 г. / arduan

… . ПЦР с достаточно большой вероятностью может дать ложноположительный результат. По принятым в России правилам, результат … результат на более чувствительном тесте — иммуноблоте. Положительный иммуноблот, является основанием для постановки диагноза ВИЧ.

СПИД
11 августа 2011 г. / Аноним

Мой результат пришол, результат не говорят сказали идти к инфекционнисту типо нет имуноблота и все результаты там…Как понять? Зачем надо идти к инфекционнисту? открыть (еще 4 сообщения)Последние 5:

11 августа 2011 г. / Владимир…

… выделило достаточно денег на тесты
Б)у вас положительный(Ложноположительный, сомнительный) результат Тестирования на вич методом ИФА, … чтобы проверить(т.е. подтвердить,или опровергнуть) его, требуется иммуноблот,которого нет,по причине, описанной мною выше …

СПИД
8 июля 2011 г. / Иван

Доброго дня! Ерик можно узнать по подробнее о анализах на вич ? Каким образом выделяют вирус из крови и что такое антиген антитело? открыть (еще 1 сообщение)Последние 5:

9 июля 2011 г. / Erik Kivexa

Иван, иммуноблот не диагностический тест, а подтверждающий, для этих целей его и используют. Ложноположительный результат — следствие перекрестных реакций на исследуемые белки, причины для этого могут …

СПИД
14 апреля 2011 г. / В.К,

Здешним фобам посвящается: 🙂 http://www.eurasiahealth.org/eng/forum/viewtopic.php?t=1139&sid=db3f74caba272252f66a14c4b3bd7810 Читайте и делайте выводы о том, как у нас работают лаборатории 🙂 И о человеческом факторе… открыть (еще 19 сообщений)Последние 5:

15 апреля 2011 г. / Илья

Для умных — сомнительный=ложноположительный (при диагностике ВИЧ). Вы бы для начала разобрасиль, что такое иммуноблот и как он делается (суть самого процесса).

СПИД
28 декабря 2010 г. / Ирина / Ростов

Здравствуйте, я беременна (1-й триместр) 2 раза сдавала анализ на ВИЧ. 1-й раз — результат сомнительный, 2-й раз (через 3 недели) — результат снова сомнительный, ПЦР- отрицательный.… открыть

28 декабря 2010 г. / Erik Kivexa

Ирина, здравствуйте. Скорее всего, это именно ложноположительный ИФА на фоне беременности. Не вижу повода для беспокойства, особенно учитывая отсутствие рисков. Но иммуноблот хорошо бы сделать для надежности и для полного исключения ВИЧ.

Клиники где можно сдать анализ

Клиника в Люберцах

ул. Преображенская улица, 4
Люберцы
Время работы:
круглосуточно

или по телефону8 (495) 432-06-70

Клиника в Отрадном

ул. Пестеля, 11
Отрадное
Время работы:
круглосуточно

или по телефону8 (495) 432-06-70

Клиника в Митино

Ул. Митинская, 28к3
Митино
Время работы:
круглосуточно

или по телефону8 (495) 432-06-70

Клиника на Аэропорту

ул. Черняховского, 8
Аэропорт
Время работы:
с 9-00 до 21-00

или по телефону8 (495) 432-06-70

Клиника на Сухаревской

ул. Селиверстов переулок, 8
Сухаревская
Время работы:
круглосуточно

или по телефону8 (495) 432-06-70

Клиника в Медведково

ул. Полярная, 32
Медведково
Время работы:
круглосуточно

или по телефону8 (495) 432-06-70

Клиника на Проспекте Вернадского

ул. Проспект Вернадского, 37к1а
Проспект Вернадского
Время работы:
круглосуточно

или по телефону8 (495) 432-06-70

Клиника на Белорусской

ул. 1-я Тверская-Ямская, 29 (3 этаж)
Белорусская
Время работы:
с 9-00 до 21-00

или по телефону8 (495) 432-06-70

Клиника на Курской

ул. Земляной вал, 38/40, стр. 6
Курская
Время работы:
с 9-00 до 21-00

или по телефону8 (495) 432-06-70

Клиника на улице Академика Янгеля

ул. Россошанская, 4,к.1
Улица академика Янгеля
Время работы:
с 9-00 до 21-00

или по телефону8 (495) 432-06-70

Клиника на 1905 года

улица 1905 года, 21
Улица 1905 года
Время работы:
с 9-00 до 21-00

или по телефону8 (495) 432-06-70

Клиника на Новых Черемушках

ул. Гарибальди, 36
Новые Черёмушки
Время работы:
с 9-00 до 21-00

или по телефону8 (495) 432-06-70

Клиника в Марьино

ул. Новомарьинская, 32
Марьино
Время работы:
круглосуточно

или по телефону8 (495) 432-06-70

Клиника на Беляево

ул. Миклухо-Маклая, 43
Беляево
Время работы:
круглосуточно

или по телефону8 (495) 432-06-70

Клиника в Солнцево

ул. Главмосстроя, 7
мкр. Солнцево
Время работы:
круглосуточно

или по телефону8 (495) 432-06-70

Клиника на Авиамоторной

ул. Авиамоторная, 41 Б
Авиамоторная
Время работы:
круглосуточно

или по телефону8 (495) 432-06-70

Клиника на Таганской

ул. Нижняя Радищевская, 14/2
Таганская
Время работы:
с 9-00 до 21-00

или по телефону8 (495) 432-06-70

Звоните и записывайтесь на прием в любое время по телефону 8 (495) 432-06-70
или

Диагностика ВИЧ у новорожденных

Анализ на СПИД у ребенка раннего возраста проводят в том случае, если установлен контакт с ВИЧ-инфицированной матерью. Серологические реакции могут быть положительными в течение 1,5 лет. Антитела в сыворотке крови новорожденного обнаруживают с помощью реакций ИФА, РИФ и иммунного блоттинга.

В течение 9 месяцев жизни ребенка положительный результат появляется в связи с наличием в сыворотке крови антител матери. Антиген р24 имеет специфичность около 65%. В некоторых случаях не удается обнаружить антитела у больного ребенка, если у него диагностировано врожденное низкое содержание глобулинов в крови. Установленный отрицательный результат иммуноблота не является гарантией отсутствия инфекции.

Тестирование проводят в несколько этапов:

  • на 1-2 сутки после рождения;
  • в 1-2 месяца;
  • в полугодовалом возрасте.

Дальнейшее изучение антител проводят до тех пор, пока не будут получены 2 отрицательных результата иммуноблота. Установление диагноза СПИД у ребенка, рожденного от ВИЧ-инфицированной женщины, возможно на основании 2 положительных результатов реакции ПЦР. Передача новорожденному возбудителя ВИЧ-инфекции исключена, если женщина не кормит ребенка грудью.

Иммунный блоттинг иммуноблот, Western Blot, вестерн-блот

В этом красивом ученом названии «blot» переводится скорее всего как «клякса», а «western» — как « западная» отражает направление распространения этой «кляксы» по бумаге слева направо, то есть на географической карте это соответствует направлению с запада на восток.». Суть метода «иммунный блот» заключается в том, что иммуноферментную реакцию проводят не со смесью антигенов, а с антигенами ВИЧ, предварительно распределенными методом иммунофореза по фракциям, располагающимся согласно молекулярному весу по поверхности нитроцеллюлозной мембраны. В результате основные белки ВИЧ, носители антигенных детерминант, распределяются по поверхности в виде отдельных полос, которые и проявляются при проведении иммуноферментной реакции.

Иммуноблот включает в себя несколько стадий:

Иммуноблот что это Иммуноблот в диагностике инфекционных заболеваний

Опубликованно 17.09.2017 00:10

Что такое иммуноблот? Это распространенный метод лабораторной диагностики вирусных инфекций человека. Он является одним из наиболее точных и надежных способов обнаружить наличие ВИЧ.

Для надежности он даже больше, чем энзим-соединенный assay иммуносорбента (elisa). Результаты иммуноблот считается неопровержимой и окончательной.Общая информация

Иммуноблот – что это? Для того, чтобы признать человека ВИЧ, вы должны пройти лабораторный метод исследования сыворотки крови на наличие антител.

Методом Вестерн-блот разделы также называется Вестерн-блот (вестерн блот). Он используется для обнаружения вирусных инфекций человека, в качестве дополнительного экспертного метода. Это необходимо для подтверждения ИФА – лабораторное исследование, позволяющее определить в крови наличие антител к ВИЧ. Иммуноблот перепроверить положительный ИФА.

Он считается наиболее чувствительным, сложным и дорогим.

Иммунный блотЦель

Что такое иммуноблот? Эта методика лабораторных исследований сыворотки крови на наличие антител к вирусу.

В ходе специальных исследований общий вирусных белков в геле и на нитроцеллюлозные мембраны.

Источник: Kashel.su

Иммуноблоттинг

Иммуноблоттинг — высокочувствительный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА. Иммуноблоттинг используют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др.

В общем смысле под иммуноблоттингом понимают анализ смеси белков, перенесенных на твердую подложку-мембрану, с которой они связываются ковалентными связями, с последующей иммунодетекцией.

Анализировать можно смесь белков, непосредственно нанесенную на подложку, — дот-блот анализ — либо после ее предварительного фракционирования методами электрофокусирования, диск-электрофореза или двумерного электрофореза — Вестерн-блот анализ (Western blotting).

Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят их из геля на активированную бумагу или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА.

Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антигенов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс (антиген + антитело больного + антитело против Ig человека) выявляют добавлением хромогенного субстрата, изменяющего окраску под действием фермента.

Такая методология применяется также для отбора клонов бактерий, фагов или вирусов, экспрессирующих продукты целевых клонированных генов.

Перенос белков на мембрану осуществляется либо пассивно, либо с использованием аппаратуры для электропереноса. На эффективность переноса белков на мембрану влияет множество факторов, таких как молекулярная масса белков, пористость геля, время переноса и состав используемого буферного раствора (транс-буфера).

В зависимости от задач и условий проведения эксперимента подбираются условия переноса, обеспечивающие наилучшие результаты. В качестве подложек обычно используют нитроцеллюлозные, поливинилидендифлуоридные (ПВДФ) или положительно заряженные нейлоновые мембраны. Нитроцеллюлоза может связывать до 80 — 100 мкг белка на 1 см2.

Низкомолекулярные белки (с молекулярной массой менее 20 кДа) могут быть утеряны в результате промывок ет возможность предварительно исследовать полиморфизм определенных генетических локусов по длинам соответствующих рестрикционных фрагментов ДНК.

Кроме того, с помощью гибридизации по Саузерну можно легко выяснить, имеет ли целевой ген участок гидролиза определенной рестриктазой в своей внутренней части, что позволяет выбирать оптимальную стратегию клонирования изучаемого района генома.

По аналогичной схеме из агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр можно перенести и молекулы РНК. Этот метод был назван Северным блоттингом (Northern blotting) в противоположность блоттингу по Саузерну (Southern blotting), так как фамилия Саузерн в английском языке означает «южный».

Перенос на фильтры из геля белков соответственно назвали Западным блоттингом (Western blotting). Крупные белки (более 100 кДа), денатурированные в растворе додецилсульфата натрия (SDS), могут слабо переноситься на мембрану, если в транс-буфере присутствует этанол. Спирт значительно улучшает перенос белков с SDS-полиакриламидного геля, но сужает поры в геле, что и приводит к задержке крупных белков.

Мембрана ПВДФ оптимизирована для проведения иммунодетекции и способна удерживать специфически связавшиеся белки до 160 мкг/см2 при очень низком уровне неспецифического связывания.

Иммуноблоттинг

Немаловажное свойство этой мембраны — возможность ее многократного использования. Нейлоновые мембраны Zeta-Probe эффективно связывают SDS-белки в отсутствие спирта, причем это связывание устойчиво к последующим обработкам. Низкомолекулярные белки также удерживаются эффективно. Благодаря высокой связывающей емкости — около 480 мкг белка на 1 см2 — мембраны Zeta-Probe позволяют обнаруживать следовые количества белка в анализируемых смесях.

После того как антиген оказывается иммобилизованным на мембране, оставшиеся центры связывания блокируют растворами желатина, либо бычьего сывороточного альбумина, либо обезжиренного молока.

Затем мембрану инкубируют в растворе поликлональных или моноклональных антител к исследуемому анти гену. После отмывки несвязавшихся антител мембрану инкубируют в растворе вторичных антител, которые представляют собой конъюгат ферментов щелочной фосфатазы (alkaline phosphatase, АР) или пероксидазы хрена (horseradish peroxidase, HRP) с антивидовыми антителами (козьи антитела к иммуноглобулинам кролика, мыши или человека) либо белками А (белок Staphylococcus aureus) или G (белок Streptococcus sp.), имеющими высокую аффинность к Fc-области иммуноглобулинов.

Детекцию образованных иммунных комплексов проводят химическим или хемилюминесцентным способом. Субстратами для химической реакции при использовании конъюгатов щелочной фосфатазы служат 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат (BCIP) или тетразолий голубой (NBT), а при использовании конъюгатов пероксидазы хрена — 4-хлор-1-нафтол и перекись водорода.

В результате ферментативных реакций на мембране образуется окрашенная полоса или пятно в месте локализации комплекса антиген-антитело.

Чувствительность данного метода составляет 100 пг белка при использовании конъюгатов АР и 100-500 пг при использовании конъюгатов HRP. Хемилюминесцентная детекция иммунных комплексов позволяет определять менее 5 пг антигена. Принцип этого метода заключается в том, что при реакции HRP с перекисью водорода и циклическим диацилгидразинлюминолом происходит эмиссия света длиной волны 428 нм, которая может быть зафиксирована на светочувствительной пленке.



Реакция иммуноблотинга (РИ) разработана на основе ИФА. Является самым специфичным и чувствительным методом иммунохимического анализа. Иммуноблотинг (от англ. blot – промокать, пятно) сочетает ИФА с электрофорезом. Применяется для выявления не комплексных антител к ВИЧ, а антитела к отдельным его структурным белкам (белки-р24, гликопротеины-gр120, gр 41 и др.). Относятся к экспертным (подтверждающим) реакциям диагностики ВИЧ-инфекции.

Реакция проводится в несколько этапов:

Вирус разрушают на компоненты — антигены (р24, gр120, gр 41 и др.), которые подвергаются электрофорезу в полиакриламидном геле, то есть разделению антигенов на фракции по молекулярной массе.

2. Гель покрывают нитроцеллюлозной мембраной и на неё при помощи электрофореза переносятся фракции антигенов. Нитроцеллюлоза ведёт себя подобно промокательной бумаге. Мембрану разрезают на полоски (стрипы). Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антигенов.

Иммуноблоттинг — дополнительный непрямой метод

Стрипы с нанесёнными на него антигенами ВИЧ погружают в сыворотку обследуемого и затем отмывают от несвязавшегося материала.

4. Стрипы инкубируют антиглобулиновой сывороткой, меченой пероксидазой, отмывают .

Добавляют субстрат и отмечают число окрашенных фракций (пятен), которые соответствуют в зоне локализации комплекса АГ-АТ.

Наличие полос на определённых участках стрипа подтверждает присутствие в исследованной сыворотке антител к строго определённым антигенам ВИЧ. Результат иммуноблоттинга считается положительным, если на мембране видны полосы, соответствующие любым двум из трех антигенов ВИЧ — р24, gp41 и gp 120 (рис.37).

РИСУНКИ

Иммунный блот Рис.5.

Споры В.anthracis.

Иммунный блот Рис.6. Капсулы К.рneumoniaе-светлые ореолы вокруг палочковидных бактерий.
Иммунный блот Рис. 7. Техника посева на твердую питательную среду.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Основная литература

Медицинская микробиология, вирусология и иммунология : учебник для студентов мед. вузов 2-е изд., испр. и доп. — 702 с. Под ред. А.А. Воробьева. М. : МИА, 2012.

2. Микробиология, вирусология и иммунология: руководство к лабораторным занятиям: учеб.пособие/(В.Б.Сбойчаков и др.); под ред. В.Б.Сбойчакова, М.М.Карапаца. – М.:ГЭОТАР-Медиа, 2014.- 320с.:ил.

3. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология [Электронный ресурс]: учебник для мед.

вузов — 760 с. — Режим доступа: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785299004250.html Коротяев А.И., Бабичев С.А. СПб.: Спецлит, 2010.

4. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология [Электронный ресурс] : учебник: в 2 т. / Т. 1. — 448 с. — Режим доступа: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142241.html Зверев В.В., Бойченко М.Н.

М. : Гэотар Медиа, 2010. .

5. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология [Электронный ресурс]: учебник: в 2 т. Т. 2. — 480 с. Режим доступа: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142242.html Зверев В.В., Бойченко М.Н. М. : Гэотар Медиа, 2010.

Дополнительная литература

1. Иммунодиагностические реакции: учебное пособие / сост.: Г.К.Давлетшина, З.Г.Габидуллин, А.А.Ахтариева, М.М.Туйгунов, А.К.Булгаков, Т.А.Савченко, Р.Ф.

Хуснаризанова, Ю.З.Габидуллин, М.М.Алсынбаев – Уфа: Изд-во ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России, 2016. — 86с.

2. Особенности некоторых свойств, определяющих патогенный потенциал сокультивируемых вариаций бактерий Еnterobacter, Сitrobacter, Serratia, E.coli, Proteus: научное издание / Ю. З. Габидуллин, Р. С. Суфияров, И. И. Долгушин – Уфа, 2015. – 250 с.

Дата добавления: 2014-10-15; Просмотров: 2804; Нарушение авторских прав?;

Главная  »  Иммуноблот – что это? Иммуноблот в диагностике инфекционных заболеваний

Иммуноблот – что это? Иммуноблот в диагностике инфекционных заболеваний

Опубликованно 17.09.2017 00:10

Иммунный блот

Что такое иммуноблот? Это распространенный метод лабораторной диагностики вирусных инфекций человека. Он является одним из наиболее точных и надежных способов обнаружить наличие ВИЧ.

Для надежности он даже больше, чем энзим-соединенный assay иммуносорбента (elisa). Результаты иммуноблот считается неопровержимой и окончательной.Общая информация

Иммуноблот – что это? Для того, чтобы признать человека ВИЧ, вы должны пройти лабораторный метод исследования сыворотки крови на наличие антител.

Методом Вестерн-блот разделы также называется Вестерн-блот (вестерн блот). Он используется для обнаружения вирусных инфекций человека, в качестве дополнительного экспертного метода. Это необходимо для подтверждения ИФА – лабораторное исследование, позволяющее определить в крови наличие антител к ВИЧ. Иммуноблот перепроверить положительный ИФА.

Он считается наиболее чувствительным, сложным и дорогим.

Иммунный блотЦель

Что такое иммуноблот? Эта методика лабораторных исследований сыворотки крови на наличие антител к вирусу.

В ходе специальных исследований общий вирусных белков в геле и на нитроцеллюлозные мембраны.

Иммуноблоттинг (выявление антител в сыворотках больных к определенным антигенам возбудителя)

Предназначен процедуру Вестерн-блот секций для определения ВИЧ-инфекции на разных стадиях. На первом этапе, очищенный вирус из составных частей подвергается электрофорезом и антигены, входящие в нее, деленной на молекулярный вес.

Вирус иммунодефицита человека размножается в живых клетках, внедренные в его генетической информации. На этой стадии, человек становится носителем вируса ВИЧ, если вы были инфицированы.

Специфика этого заболевания заключается в том, что он долгое время не проявляется. Вирус разрушает лимфоциты, таким образом, у человека снижается иммунитет и организм становится неспособным бороться с инфекциями.

Если ВИЧ-это правильно и своевременно лечить, пациент будет жить до глубокой старости. Отсутствие лечения неизбежно приводит к смерти. С момента инфекции, но без лечения, максимальный срок не более десяти лет.

Иммунный блот Особенности

Анализ иммуноблот-это надежный метод, который позволяет определить наличие антител к ВИЧ-антигенам первого и второго типа.

Если человек инфицирован, после двух недель антитела, которые могут быть обнаружены значительно позже. Особенностью ВИЧ является то, что количество антител быстро увеличивается и остается в крови пациента. Даже если они присутствуют, болезнь может никак не проявляться в течение двух или более лет. Метод ИФА не всегда точно указывает на наличие болезни, требующая подтверждения результатов от-ПЦР и Вестерн-блот разделы, если иммуноферментный анализ показал положительный результат.

Иммунный блотПоказания к

Что это за «иммуноблот» уже выяснили, но которые вводят в исследовании?

Поводом к проверке на вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) иммуноблот станет положительным результатом ИФА. Нужно пройти через твердофазного иммуноферментного анализа у больных, которым предстоит операция. Кроме того, вы должны сделать анализ планирующих беременность женщин, а также тех, кто ведет беспорядочную половую жизнь. Вестерн-блот разделах назначают пациентам с ВИЧ-инфекцией, если результаты elisa являются сомнительными.

Поводом для обращения к врачу могут быть следующие тревожные симптомы: быстрая потеря веса;слабость, потеря функции;расстройства кишечника (понос), которая длится три недели;обезвоживание;лихорадка;увеличение лимфатических узлов в организме;развитие кандидоза, туберкулеза, пневмонии, токсоплазмоз, обострение герпеса.

Пациенту не нужно готовиться перед сдачей венозной крови.

За 8-10 часов перед тестом не кушать. Не рекомендуется за день до сдачи крови употреблять алкоголь и кофейных напитков, тяжелых физических упражнений, испытывать волнение.

Иммунный блотГде сделать анализ?

Где я могу пройти тестирование на ВИЧ?

ИФА, иммуноблот анализа, проведенного в городских частных клиниках, результаты дают в течение дня. Возможна и срочная диагностика. В общественных учреждениях, медицинских тестов elisa и Вестерн-блот секции бесплатно, в соответствии с законодательством Российской Федерации.

Обязательную проверку на инфекционные заболевания беременных женщин, и больных, нуждающихся в госпитализации или хирургического вмешательства.Как проводится это исследование?

Как провести ИФА? Иммуноблот положительный/отрицательный подтверждает или опровергает результаты elisa. Процедура достаточно простая. Специалист осуществляет забор венозной крови, по времени это занимает менее пяти минут.

После отбора пробы, место инъекции следует продезинфицировать и заклеить пластырем. Забор проводится натощак, поэтому после процедуры не помешает съесть плитку горького шоколада или сладкий горячий напиток.

Иммунный блот

Чтобы получить направление на бесплатный анализ в государственном медицинском учреждении, необходимо посетить терапевта.

В целом, иммуноблот не отличается от других исследований крови путем забора. Методология исследования проста. Если в крови человека присутствует вирус, организм для его уничтожения начинает вырабатывать антитела. Для каждого вируса существует множество белковых антигенов. Обнаружение этих антител является основой метода Вестерн-блот разделы. Стоимость

Сколько анализ? Иммуноблот ВИЧ относится к дешевым исследований.

В среднем, скрининговые методы иммуноанализа составляет от 500 до 900 рублей. Вестерн-блот разделов является изучение проверки, стоимость которых колеблется от трех до пяти тысяч рублей. Более сложные методы намного дороже. Например, для анализа полимеразной цепной реакции (ПЦР) нужно будет заплатить около 12000 рублей.

Иммунный блотИнтерпретация результатов

Наиболее распространенные методы диагностики ВИЧ-инфекции является иммуноферментный анализ и иммуноблот.

Они это для определения в сыворотке антител к вирусу иммунодефицита человека. Инфекция обычно подтверждается двух тестов: скрининг и подтверждающий. Интерпретация результатов должна производиться врачом, он диагностирует и назначает лечение. Если иммуноблот положительный, это означает, что в человеческом организме вирус.

Положительный результат не должен стать поводом для самостоятельного лечения, поскольку каждый пациент может иметь свои собственные картины заболевания.

Качественный анализ включает в себя скрининг и сертификационный. Если у пациента не обнаруживается вирус, результат показывает «отрицательно». Когда обнаружен данный сертификат, скрининг проводят дополнительные исследования. Иммуноблот анализ, который подтверждает или опровергает скрининга. Если тест-полоски появляются в потемнение определенных областях (локализация белков), поставлен диагноз «ВИЧ».

Если результаты сомнительны, то испытания проводятся в течение трех месяцев.

Чтобы предотвратить заражение вирусом иммунодефицита человека возможно, если соблюдать определенные правила: избегать случайных половых контактов, использовать презервативы при контакте, не употребляю наркотики.

Если заболевание обнаружено у беременной женщины, важно следовать рекомендациям лечащего врача, не забывать о тесты на наличие вируса.

Категория: Здоровье

Что такое вестерн-блоттинг?

Идентификация белка всложных смесях или экстрактах различных тканей является одной из часто встречающихся задач. Используя такой инструмент как специфичные антитела, можно определить исследуемый белок с минимумом временных и финансовых затрат.

В методе Вестерн-блоттинг (Western blotting) на первом этапе смесь белков разделяется методом электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН), затем переносится на нитроцеллюлозную мембрану методом электроблоттинга.

Суть данного метода заключается в том, что гель после электрофореза помещается на нитроцеллюлозную мембрану между слоями фильтровальной бумаги. Собранный таким образом «сэндвич» помещается в электрическое поле так, что комплексы белок-ДСН движутся поперек пластины геля и иммобилизуются (в результате неспецифической сорбции) на поверхности нитроцеллюлозной мембраны.

В связывании комплекса белок-ДСН с нитроцеллюлозной мембраной принимают участие в основном силы электрической природы, причем данное взаимодействие является многоточечным и приводит к «распластыванию» белков на поверхности мембраны. Таким образом, после электропереноса мы получаем на нитроцеллюлозе реплику геля с белками, расположенными так же, как и в полиакриламидном геле.

После проведения ДСН — электрофореза, электропереноса и сорбции белков из геля на нитроцеллюлозную мембрану третичная конформация белка сильно изменена, если вообще правильно говорить о существовании третичной структуры для белка после такой жесткой обработки. Поэтому для иммунохимической детекции исследуемого белка обычно используются только моно- или поликлональные антитела, специфичные к линейным участкам белковой молекулы.

51. Иммуноферментный анализ, иммуноблоттинг. Меха­низм, компоненты, применение.

Антитела, специфичные к конформационным эпитопам (или участкам, включающим в себя межсубъединичные контакты), как правило, не пригодны для использования в методе Вестерн-блоттинг.

После переноса белков мембрану инкубируют последовательно с антителами, специфичными к исследуемому белку, а затем со вторичными антителами, специфичными к Fc-фрагментам первичных антител, конъюгированными с ферментной (или какой-либо другой) меткой (рис.

1 А). В случае, когда с меткой конъюгированы непосредственно первичные, специфичные к исследуемому антигену антитела, вторичные антитела не требуются (рис. 1 Б). Образовавшиеся в месте локализации исследуемого белка иммунные комплексы «проявляются» с помощью хромогенного субстрата (зависит от типа метки).

Чувствительность и специфичность метода сильно зависят от того, какие антитела используются при проведении исследований.

Используемые антитела должны быть специфичны к уникальной, характерной только для исследуемого белка последовательности аминокислот. В противном случае возможно взаимодействие (особенно в случае грубых белковых экстрактов) антител с несколькими белковыми молекулами, что в свою очередь приведет к появлению на мембране нескольких окрашенных полос.

Идентификация исследуемого белка в таком случае часто бывает затруднительной либо вообще невозможной.

Вторым важным фактором, о котором следует помнить при выборе антител, является аффинитет. Чем выше аффинитет используемых антител, тем ярче и четче прокрашиваются белковые полосы, тем выше чувствительность метода. При использовании высокоаффинных антител можно достичь чувствительности 1 нг и даже выше.

Для визуализации результата взаимодействия связанного с мембраной антигена и антител используют вторичные антитела, конъюгированные с агентами, способными в определенных условиях давать определенный сигнал.

Обычно в качестве такого агента используют фермент (пероксидазу или фосфатазу), продукт реакции которого имеет окраску и выпадает на мембране в виде нерастворимого осадка.

Также в данном методе возможно использование флуоресцентных меток.

Иммунный блот

Рис. 1. Схема иммунохимического окрашивания исследуемого белка: А — с использованием вторичных антител, конъюгированных с ферментной меткой; Б — первичное антитело напрямую конъюгировано с ферментной меткой.

Протокол:

I. Подготовка геля и мембраны и электроперенос белков

Полиакриламидный гель после проведения электрофореза помещают в ванночку с буфером для блоттинга (25 мМ Трис, рН 8,3, 192 мМ глицин, 10% этанол).

Два листа фильтровальной бумаги, вырезанные по форме кассеты для блоттинга и смоченные буфером для блоттинга, помещают на ту часть кассеты, которая будет обращена к аноду. Затем на фильтровальную бумагу помещают предварительно смоченную тем же буфером нитроцеллюлозную мембрану, следя за тем, чтобы между мембраной и бумагой не было пузырей воздуха.

После этого на мембрану следует осторожно поместить гель, снова обратив особое внимание на отсутствие пузырей воздуха между гелем и мембраной. Завершают формирование сэндвича два слоя смоченной фильтровальной бумаги, которые помещаются на поверхность геля (Рис. 2). Полученный сэндвич зажимается в кассете и помещается между электродами так, чтобы мембрана была обращена к аноду.

Иммунный блот

Рис. 2. Схема электропереноса белков на мембрану.

II. Электроперенос

Электроперенос белков на нитроцеллюлозную мембрану проводят в буфере, содержащем 25 мМ Трис, рН 8,3, 192 мМ глицин, 10% этанол в течение 30-50 мин при постоянном напряжении 100 В.

Время электропереноса зависит от размера переносимых белков, чем больше белок, тем дольше осуществляется электроперенос. Качество электропереноса и расположение белковых полос оценивают, окрашивая нитроцеллюлозную мембрану 0,3% раствором Ponceau S в 1% уксусной кислоте. Перед проведением иммунохимического окрашивания мембрану следует промыть несколько раз слабо щелочным водным раствором Трис для удаления связавшегося с белками красителя.

III. Иммунохимическое окрашивание белков, иммобилизованных на нитроцеллюлозной мембране

Для блокирования мест неспецифического связывания антител мембрану инкубируют при постоянном перемешивании при комнатной температуре в течение 30 мин в PBST (для лучшей блокировки можно использовать раствор PBST, содержащий 10% сухое обезжиренное молоко).

После блокировки мембрану инкубируют в течение часа при комнатной температуре и постоянном перемешивании в PBST, содержащем 1-10 мкг/мл специфичных антител.

Оптимальная концентрация антител подбирается эмпирически и зависит от аффинности взаимодействия антител с антигеном.

По окончании инкубации мембрану промыть 5 раз PBST и перенести в раствор вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена. Разведение конъюгата обычно указывается производителем на упаковке, либо подбирается исследователем эмпирически. В растворе вторичных антител мембрану инкубировать 1 час при постоянном перемешивании.

После тщательной отмывки (минимум 5 — 6 раз менять буфер) PBST мембрану переносят в раствор хромогенного субстрата, содержащий 3 мг диаминобензидина (ДАБ) и 10 мкл 30% перекиси водорода в 10 мл 0.1 М трис-HCl, рН 7,6.

Инкубацию проводят при перемешивании 5 — 10 минут. Мембрану после окончания инкубации с субстратом следует промыть PBST, подсушить, промокнув фильтровальной бумагой, и сразу же сделать электронную копию, сканируя в цвете. Если мембрана полностью высыхает, прокрашенные белковые полосы бледнеют, и изображение получается менее ярким и контрастным.

Примечание: ДАБ является токсичным веществом и потенциальным канцерогеном. Работать только в резиновых перчатках!

Источник: ekoshka.ru


You May Also Like

About the Author: admind

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Этот сайт использует Akismet для борьбы со спамом. Узнайте, как обрабатываются ваши данные комментариев.