Иммуноблоттинг на вич


Иммуноблоттинг на вич

Иммуноблоттинг (иммуноблот) – высокоспецифичный и высокочувствительный референтный метод, подтверждающий диагноз для пациентов с положительными или неопределенными результатами анализов, полученных в т.ч. при помощи РПГА или ИФА.

Этот метод выявления антител к отдельным антигенам возбудителя основан на постановке ИФА на нитроцеллюлозных мембранах, на которые в виде отдельных полос нанесены специфические белки, разделенные гель-электрофорезом. Если имеются антитела против определенных антигенов – появляется темная линия в соответствующем локусе стрипа. Уникальность иммуноблота заключается в его высокой информативности и достоверности получаемых результатов.

Материалом для исследования является сыворотка или плазма крови человека. Для исследования на одном стрипе необходимо 1,5-2 мл крови или 15-25 мкл сыворотки.


По рекомендации ВОЗ иммуноблотинг (вестерн-блот) используется при диагностике ВИЧ-инфекции в качестве дополнительного экспертного метода, который должен подтверждать результаты ИФА. Обычно этим методом перепроверяют положительный результат при ИФА, поскольку он считается более чувствительным и специфичным, хотя более сложным и дорогим.

Иммунный блоттинг сочетает в себе иммуноферментный анализ (ИФА) с предварительным электрофоретическим разделением белков вируса в геле и их переносом на нитроцеллюлозную мембрану. Процедура иммуноблота состоит из нескольких стадий. Сначала предварительно очищенный и разрушенный до составных компонентов ВИЧ подвергается электрофорезу, при этом все входящие в состав вируса антигены разделяются по молекулярному весу. Затем методом блоттинга антигены переносят из геля на полоску нитроцеллюлозы или нейлонового фильтра, которые отныне содержат невидимый пока глазом спектр белков, характерный для ВИЧ. Далее на стрип наносится исследуемый материал (сыворотка, плазма крови пациента и т.п.), и если в пробе есть специфические антитела, то они связываются со строго соответствующими им полосками белков-антигенов. В результате последующих манипуляций (подобных ИФА) результат этого взаимодействия визуализируется – делается видимым. Наличие полос на определённых участках стрипа подтверждает присутствие в исследованной сыворотке антител к строго определённым антигенам ВИЧ.

Иммунный блоттинг чаще всего используют для подтверждения диагноза ВИЧ-инфекции.


З считает положительными сыворотки, в которых методом иммунного блотинга обнаруживаются антитела к каким-либо двум белкам оболочки ВИЧ. Согласно этим рекомендациям, при наличии реакции только с одним из белков оболочки (gp160, gp120, gp41) в сочетании или без реакции с другими белками, результат считается сомнительным и рекомендуется повторное исследование, с использованием набора другой серии или другой фирмы. Если и после этого результат остается сомнительным, исследования продолжаются через каждые 3 месяца.

Особенности

Иммуноблоттинг на вич

Иммуноблот анализ – достоверный метод, который позволяет определить наличие антител к антигенам ВИЧ первого и второго типа. Если человек инфицирован, уже через две недели появляются антитела, которые могут обнаруживаться и намного позднее. Особенность ВИЧ в том, что количество антител быстро увеличивается и сохраняется в крови больного. Даже если они присутствуют, болезнь может не проявлять себя в течение двух и более лет. Метод ИФА не всегда точно определяет наличие заболевания, поэтому требуется подтверждение результатов с помощью иммуноблоттинга и ПЦР, если иммуноферментный анализ показал положительный результат.

Показания к назначению

Что это такое «иммуноблот» уже выяснили, но кому назначают данное исследование? Поводом сдать анализы на вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) методом иммуноблоттинга становится положительный результат ИФА. Необходимо пройти через иммуноферментный анализ пациентам, которые будут оперироваться. Кроме этого, следует сделать анализ женщинам, планирующим беременность, а также всем, кто ведет беспорядочную половую жизнь. Назначают иммуноблоттинг пациентам с ВИЧ, если результаты ИФА вызывают сомнения.


Поводом для обращения к врачу могут стать следующие тревожные симптомы:

  • резкое похудение;
  • слабость, потеря работоспособности;
  • расстройство кишечника (диарея), которое продолжается в течение трех недель;
  • обезвоживание организма;
  • лихорадка;
  • увеличение лимфатических узлов на теле;
  • развитие кандидоза, туберкулеза, пневмонии, токсоплазмоза, обострение герпеса.

Пациенту не нужно подготавливаться перед сдачей венозной крови. За 8-10 часов до исследования нельзя принимать пищу. Не рекомендуется за сутки до сдачи крови употреблять алкогольные и кофейные напитки, заниматься тяжелыми физическими упражнениями, испытывать волнение.

Как проводится исследование?

Иммуноблоттинг на вич

С точки зрения пациента иммуноблот никак не отличается от любого другого анализа: берется венозная кровь, исследуется и получается результат. Но если вдаться немного подробнее методику, то она очень не простая, но все же попробуем разобраться.


Вначале, на заводе-производителе реактивов, берется «эталонный» вирус иммунодефицита человека. Затем при помощи специальной процедуры (электрофореза) в гелевой среде вирус разрушается до его мельчайших составляющих: белков (антигенов вируса). Затем при помощи самого блоттинга (от англ. промокания) частицы располагают на специальном материале – нитроцеллюлозе или нейлоновом фильтре, получается готовый к использованию индикатор, так называемый стрип. Стрип – это полоска, в которой антигены распределены в зависимости от своей молекулярной массы, в четкой последовательности, то есть каждому миллиметру бумаги соответствует определенный белок.

Как вы, возможно, знаете если в крови человека присутствуют вирусы, то организм начинает вырабатывать против их оболочек (определенных белков) антитела, при чем для каждого вируса имеется свой индивидуальный набор белков-антигенов. Выявление антител к белкам-антигенам в крови есть основа метода иммуноблот. Ведь если антитело сталкивается с антигеном, то они непременно взаимодействуют друг с другом – «прилипают».

Так вот, антигены находятся на стрип-полоске и в случае наличия в крови исследуемого подходящих антигенов они обязательно взаимодействуют друг с другом а в этом месте, на стрип полоске, проявится индикатор – появится плоска (как тест на беременность). Причем в конкретном месте полоски, таким образом врач поймет есть ли в крови набор белков характерных для того или иного вируса.


Так, к примеру, при наличии на полоске потемнения в местах локализации белков gp160, gp120, gp41диагностируется ВИЧ, для других вирусов это будут совсем другой набор белков.

Нужно отметь, что иммуноблот позволяет точно установить наличие вируса только в том случае, если набор антител в крови является полным, то есть если белки gp160, gp120, gp41 присутствуют одновременно, то это 100% ВИЧ инфекция. А вот если хотя бы одного нет, к примеру: gp41 отсутствует, а есть только gp160, gp120, то тест расценивается как сомнительный и требует повторения.

Частые вопросы

Какие стадии включает иммуноблот?

  1. Подготовка стрипа.Предварительно очищенный и разрушенный до составных компонентов вирус иммунодефицита (ВИЧ) подвергается электрофорезу, при этом входящие в состав ВИЧ антигены разделяются по молекулярному весу. Затем методом блоттинга (аналог выдавливания на «промокашку» избытка чернил) антигены переносят на полоску нитроцеллюлозы, которая отныне содержит невидимый пока глазом спектр антигенных полос, характерный для ВИЧ.
  2. Исследование пробы.На нитроцеллюлозную полоску наносится исследуемый материал (сыворотка, плазма крови пациента и т.п.), и если в пробе есть специфические антитела, то они связываются со строго соответствующими им (комплиментарными) антигенными полосами. В результате последующих манипуляций результат этого взаимодействия визуализируется – делается видимым.
  3. Трактовка результата.Наличие полос в на определённых участках нитроцеллюлозной пластины подтверждает присутствие в исследованной сыворотке антител к строго определённым антигенам ВИЧ.
  • Полоска А – Положительный контроль
  • Полоска В – Слабоположительный контроль
  • Полоска С – Отрицательный контроль
  • Полоска D – Положительный образец (обнаружено присутствие антител к ВИЧ-1)

Как расшифровать анализ?

Иммуноблоттинг на вич

Если ИФА показал наличие всех или почти всех антител к антигенам согласно данной тест-системы, это обозначает положительный анализ на ВИЧ. Если ответ после проведения второго серологического иммуноферментного анализа положительный, то необходимо провести иммуноблот. Расшифровка результатов его будет более верной. Если иммуноферментный анализ дал положительный результат, следующий анализ иммуноблота так же показал наличие ВИЧ, то ставится заключительный результат.

Когда расшифровываются анализы, то надо знать, что положительный тест на ВИЧ определяется:

  • от 60% до 65% через 28 дней после заражения;
  • в 80% – через 42 дня;
  • в 90% – через 56 дней;
  • в 95% – через 84 дня.

Если получен ответ на ВИЧ положительный, то это будет означать, что выявлены антитела к вирусу. Чтобы избежать ложноположительного ответа, надо сдать повторно анализы, желательно два раза. Если антитела к иммунодефициту выявлены при сдаче двух анализов из двух либо при сдаче 3-х анализов в 2-х из них, то считается, что результат положительный.


Антиген р 24 можно выявить в крови уже через 14 дней со дня заражения. С помощью метода иммуноферментного анализа этот антиген выявляется от 14 до 56 дней. По прошествии 60 дней его в крови уже нет. Только когда в организме формируется СПИД, происходит повторно рост этого белка р24 в крови. Поэтому тест-системы иммуноферментного анализа используются, чтобы обнаружить ВИЧ в первые дни заражения либо для того, чтобы определить, как протекает заболевание и контролировать процесс лечения. Высокая аналитическая чувствительность иммуноферментного анализа обнаруживает антиген р24 в биологическом материале при ВИЧ первого подтипа в концентрации от 5 до 10 пкг/мл, при ВИЧ второго подтипа от 0,5 нг/мл и меньше.

Под сомнительным результатом иммуноферментного анализа подразумевается, что при диагностировании где-то ошиблись, как правило, что-то перепутали медицинские работники, или у человека есть признаки инфицирования, а результат отрицательный, что вызывает подозрение, человека направляют на повторную сдачу анализа.

Под ложноположительным результатом понимается результат, когда сдача анализов крови была сделана при следующих состояниях больного:

  • беременность;
  • если у человека нарушен гормональный фон;
  • при продолжительной иммунодепрессии.

Как расшифровать анализ в этом случае? Ложноположительный результат ставится, если выявляется хотя бы один белок. Из-за того, что антиген р24 очень зависит от индивидуальных вариаций, то, используя этот метод, в первый период заражения выявляется от 20% до 30% больных.

Насколько достоверен положительный результат теста?

Иммуноблоттинг на вич

Иногда у ИФА бывают ложноположительные результаты (примерно в 1% случаев), причиной подобного результата может быть беременность, различные вирусные инфекции, а также простая случайность. После получения положительного результата необходим более точный тест – иммуноблот, по результатам которого и ставится диагноз. Положительный результат иммуноблота после положительного ИФА достоверен на 99,9% – это максимальная точность для любого медицинского теста. Если иммуноблот отрицательный, значит, первый тест был ложноположительным, и на самом деле ВИЧ у человека нет.

Что такое неопределенный (сомнительный) результат?

Если ИФА бывает положительным или отрицательным, то иммуноблот может быть положительным, отрицательным или неопределенным. Неопределенный результат иммуноблота, т.е. наличие в иммуноблоте хотя бы одного белка к вирусу, может наблюдаться, если заражение произошло недавно и в крови еще мало антител к ВИЧ, в этом случае иммуноблот станет положительным через некоторое время. Также неопределенный результат может появиться при отсутствии ВИЧ-инфекции при гепатите, некоторых хронических заболеваниях обменного характера, или при беременности. В этом случае, либо иммуноблот станет отрицательным, либо будет обнаружена причина неопределенного результата.


Сколько стоит анализ?

Иммуноблот на ВИЧ не относится к дешевым исследованиям. В среднем, скрининговое обследование иммуноферментными методами стоит от 500 до 900 рублей. Иммуноблоттинг – это верификационное исследование, стоимость которого составляет от трех до пяти тысяч рублей. Более сложные методы стоят намного дороже. Например, за анализ полимеразной цепной реакции (ПЦР) нужно будет заплатить около 12000 рублей.

Где сделать анализ?

Где можно сдать анализ на ВИЧ? ИФА, иммуноблот исследования проводят в городских частных клиниках, результаты выдают в течение суток. Возможна и срочная диагностика. В государственных медицинских учреждениях анализы ИФА и иммуноблоттинг проводят бесплатно, согласно законодательству РФ. В обязательном порядке проверку на инфекционные заболевания проходят беременные женщины, а также пациенты, которым предстоит госпитализация или оперативное вмешательство.

Источник: mfina.ru

Основные виды диагностики ВИЧ-инфекции


Вирусологическая диагностика основана на выявлении ВИЧ в тканях и биологических жидкостях больного.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) применяется с целью выявления вируса и оценки вирусной нагрузки, что позволяет судить об эффективности специфического лечения и прогнозировать течение инфекционного заболевания.

Серологическая диагностика ВИЧ-инфекции предполагает выявление антигенов вируса и антител в сыворотке крови. Обнаружение антител к вирусу иммунодефицита человека с помощью ИФА (иммуноферментного анализа) является основным методом лабораторной диагностики. Все положительные результаты подтверждаются методом иммуноблоттинга. Экспресс тест на ВИЧ основан на выявлении антител в крови и биологических жидкостях исследуемого. Используются в случаях, когда необходимо быстро получить результат.

Уровень иммуносупрессии определяется методикой подсчета СD4 и СD8-лимфоцитов, с последующим определением соотношения CD4 : CD8.

Каждый из лабораторных методов диагностики ВИЧ-инфекции характеризуется определенной чувствительностью (% верно определенных среди заведомо (+) образцов) и специфичностью (% правильно определенных тестов среди заведомо отрицательных образцов). Результаты теста на ВИЧ интерпретируются как отрицательные, положительные или сомнительные.

Иммуноблоттинг на вичиммунная клетка

Рис. 1. На фото слева ВИЧ заражают иммунную клетку (обозначено желтым). На фото справа лимфоцит, поражённый ВИЧ. Вытянутые структуры на поверхности клетки вызваны гиперпродукцией белка.

Иммуноблоттинг на вичвирионы вич

Рис. 2. На фото зафиксирован процесс выхода (отпочкования) вирионов из инфицированной клетки.

Анализ крови на ВИЧ. Что надо знать

Анализ крови на ВИЧ может сделать любой житель нашей страны по своему желанию анонимно и бесплатно. Но есть категории лиц, которые обследуется на ВИЧ в обязательном порядке. К ним относятся:

  • все доноры крови и ее компонентов, а также тканей и других биологических жидкостей;
  • лица, которым была проведена трансфузия или осуществлена трансплантация (проводится в течение первых 3-х месяцев после проведения процедуры);
  • беременные;
  • лица, пострадавшие в результате аварии;
  • лица, имеющие клинические показания — лихорадку, диарею, постоянный кашель и увеличение более 2-х групп лимфатических узлов, длящиеся более 1-го месяца, необъяснимую потерю веса, СПИД-ассоциированные и оппортунистические инфекционные заболевания, соматическая и онкопатология;
  • иностранные граждане;
  • лица из группы риска (наркоманы и страдающие венерическими заболеваниями).

Тест на ВИЧ необходимо проводить всем, кто был подвергнут риску заражения.

Иммуноблоттинг на вичгде сдать анализ на вич

Рис. 3. Анализ крови на ВИЧ в нашей стране можно сдать анонимно и бесплатно.

Где сдать кровь на ВИЧ

Анализ на ВИЧ можно сдать бесплатно в учреждениях здравоохранения, работающих на бюджетной основе при наличии паспорта и медицинской страховки. Врачи при этом обязаны хранить врачебную тайну. Бесплатно и анонимно можно сдать анализ в Центрах профилактики и борьбы со СПИДом и там же получить врачебную консультацию до и после обследования. На платной основе проводится тестирование на ВИЧ в коммерческих лечебных учреждениях. Тест на ВИЧ может пройти любой человек, временно проживающий на данной территории.

В лаборатории будет сделан анализ крови на ВИЧ иммуноферментным методом (ИФА).

Анализ на ВИЧ анонимно

В государственных учреждениях здравоохранения (поликлиниках и больницах) анонимно сдать анализ крови на ВИЧ нельзя. Сведения о результатах исследования будут известны узкому кругу медиков, которые обязаны хранить врачебную тайну.

Кабинеты анонимного тестирования существуют на базах Центров СПИДа, где каждому исследованию присваивается номер.

Иммуноблоттинг на вичсдать кровь на вич

Рис. 4. Пробирки с кровью отправляются на серологическое исследование.

Анализ на ВИЧ принудительно

Существует четыре группы населения, тестирование на ВИЧ которых является обязательным, но не насильственным:

  1. Доноры крови и другого биологического материала.
  2. При устройстве на работу в учреждения, где работник может иметь контакт с заведомо инфицированным материалом и больными.
  3. Иностранные граждане при получении виз для проживания (более 3-х месяцев) на территории РФ.
  4. При наличии клинических показаний лицам, находящихся в местах лишения свободы.

Принудительное тестирование населения на ВИЧ является бесперспективным и противоречит соблюдению прав человека. Принудительное тестирование населения в РФ является незаконным.

Иммуноблоттинг на вичдиагностика вич

Рис. 5. Тестирование на ВИЧ осужденных проводится по клиническим показаниям.

Сколько стоит анализ на ВИЧ

В государственных учреждениях обследование на ВИЧ бесплатное, в частных клиниках — платное:

  • Стоимость ИФА составляет от 400 до 800 руб. Ответ будет готов по истечении одних суток. Существует срочная диагностика, когда ответ можно получить в течение 2-х часов.
  • Стоимость анализа на ВИЧ методом иммуноблота составляет от 3 до 5 тыс. рублей. Результат будет готов через 4 — 7 дней.
  • Стоимость теста на ВИЧ методом ПЦР составляет 10 — 12 тыс. руб. Результат будет готов через 10 — 14 дней.

Сколько делается анализ на ВИЧ

В государственных учреждениях срок получения результатов анализа на ВИЧ составляет:

  • При применении ИФА 3-го поколения результаты дают самый достоверный результат через 12 недель от момента предполагаемого инфицирования.
  • При применении ИФА 4-го поколения — 6 недель.
  • При применении ПЦР — 4 недели.

Как сдавать анализ на ВИЧ

  • Сдавать анализ на ВИЧ необходимо не ранее, чем через 3 — 4 недели от предполагаемого заражения.
  • Тестирование проводится не ранее, чем через 8 часов после приема пищи.

Из жидкости можно употреблять только обычную воду.

  • Для анализа осуществляется забор 3 — 5 мл крови, взятой из локтевой вены, для чего используется обычный шприц или игла с помпой.
  • До транспортировки в лабораторию сыворотка крови может храниться в холодильнике до 7-и дней. Без холодильника не более 30 минут после забора.
  • Транспортировка пробирок с сывороткой крови осуществляется в специальных термоконтейнерах при температуре +4 — +8оС.

Иммуноблоттинг на вичобщий анализ крови при вич

Рис. 6. Для анализа на ВИЧ необходимо провести забор 3 — 5 мл крови, взятой из локтевой вены — для чего используется обычный шприц (фото слева) или игла с помпой (фото справа).

При заборе крови из вены вирусом иммунодефицита человека заразиться невозможно.

Ложноположительный анализ на ВИЧ и другие виды результатов исследования

Результаты анализа на ВИЧ могут трактоваться как положительные, отрицательные и сомнительные.

Сомнительный результат теста на ВИЧ получается при присутствии в сыворотке крови антител, которые перекрестно реагируют с белками вируса иммунодефицита человека. Анализ в данном случае сдается повторно, а при его проведении будут применяться белее специфичные тест-системы. Если сомнительный результат сохраняется, то тестирование необходимо проводить каждые 1 — 3 месяца в течение полугода.

Положительный результат теста на ВИЧ (серопозитивный) говорит о наличии в крови исследуемого антител к вирусу. В данном случае иммуноферментный анализ (ИФА) повторяется и при получении повторного положительного результата подтверждается тестом иммуноблотинга с тем же образцом крови.

Отрицательный результат теста на ВИЧ (серонегативный) говорит об отсутствии ВИЧ-инфекции, либо инфицирование произошло совсем недавно и в крови обследуемого еще не выработались антитела (период «окна»). В таком случае обследование следует повторить через 3 и 6 месяцев.

Ложноположительный результат теста на ВИЧ регистрируется тогда, когда его причиной явился не вирус иммунодефицита человека, а беременность, аутоиммунное заболевание, аллергия, любое другое инфекционное заболевание, недавно сделанная прививка, онкопатология, трансплантация органа и даже обычная еда (семечки, острая, жирная и кислая пища, употребленная накануне, и даже минеральная сильногазированная вода). Большое количество ложноположительных результатов получается при проведении тестирование в домашних условиях.

Ложноотрицательный результат теста на ВИЧ говорит о том, что вирус в крови больного присутствует, но антитела еще не выработались. При проведении анализа ПЦР ложноотрицательный результат может быть получен у ВИЧ-инфицированных больных в период проведения специфического лечения, когда концентрация вирусов в крови настолько мала, что приводит к несрабатыванию тест-системы. В большинстве случаев ложноотрицательный результат получается при технической ошибке или браке в тест-системе, что встречается крайне редко ввиду проведения жесткого контроля качества на всех уровнях.

Анализ на ВИЧ необходимо отложить минимум на две недели после перенесенного инфекционного заболевания или вакцинации.

Иммуноблоттинг на вичсерологическое исследование вич

Рис. 7. Проведение серологического исследования крови.

Тест-системы, определяющие наличие антител к ВИЧ

При помощи тестирования на антитела к вирусу иммунодефицита человека оценивается ответ организма на инфицирование. С этой целью применяется иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA), позволяющий обнаружить антитела к белкам вируса и подтверждающий анализ иммуноблотинг (вестерн-блот), при помощи которого определяется реакция антител на белки вируса.

Антитела к ВИЧ

Вирусы иммунодефицита человека обладают антигенными свойствами и при попадании в организм человека вызывают синтез антител — специфических иммуноглобулинов. С помощью современных тест-систем в сыворотке крови и других биологических жидкостях больного ВИЧ можно определить класс иммуноглобулинов (антител). Раньше всех (через неделю после инфицирования) появляются иммуноглобулины класса IgМ. Их рост отмечается в течение месяца и далее они сохраняются еще около 30 дней. Иммуноглобулины класса IgG циркулируют в крови несколько лет. Их выявление является показателем наличия ВИЧ-инфекции.

Антитела к ВИЧ появляются через 2 — 4 нед. после инфицирования и далее они определяются в крови на протяжении всего заболевания.

Период «окна» при ВИЧ

Антитела в организме инфицированного человека вырабатываются не сразу. На первых порах ВИЧ-инфекция ничем себя не проявляет. Антитела появляются в крови в среднем через 2 — 3 месяца от момента заражения (от 2-х недель до 6-и месяцев). Этот период получил названия «окна», когда анализы на антитела еще отрицательные, но вирусы интенсивно размножаются, а сам больной становится опасным в плане заражения контактных лиц. Выявить инфицированного можно через более короткий (1 — 2 недели) период после заражения, для чего применяется полимеразная цепная реакция (ПЦР). Однако из-за дороговизны данный вид исследования для скрининга не используется.

Иммуноферментный анализ при диагностике ВИЧ

У 90 — 95% инфицированных лиц антитела в сыворотке крови появляются через 3-и месяца после заражения, У небольшой части больных (5 — 9 %) антитела появляются в период от 3 до 9 месяцев и у 0,5 — 1% — в более поздние сроки. В терминальной стадии СПИДа количество антител снижается значительно, а в некоторых случая исчезают вовсе.

С 1985 года данная методика используется на территории РФ с целью массовых исследований. Он прост в исполнении, показывает довольно точные результаты, является дешевым по сравнению с другими методиками. В связи с возможностью получения ложноположительных результатов все положительные результаты исследуются дважды, после чего сыворотка крови больного исследуется подтверждающим тестом — иммунного блота. При этом используется тот же образец крови. При наличии 2-х положительных результатов с применением ИФА и иммуноблота в одной пробе ставиться диагноз ВИЧ-инфекции.

В РФ используются обычно ИФА 4-го поколения. Исследование проводится с целью получения суммарного спектра антител против белков (антигенов) ВИЧ — р24 и gр160.

Тест видит как антитела, которые вырабатываются организмом больного, так и антигены (белки вируса) р24. «Период окна» для тестов 4-го поколения более короткий. Уже через месяц можно получать достоверные результаты. Однако более надежными, как считают специалисты здравоохранения РФ, являются сроки 6, 8 или 12 недель.

Иммуноблоттинг на вичиммуноферментные анализаторы вич

Рис. 8. На фото иммуноферментные анализаторы.

Иммуноблоттинг на вичанализатор вич

Рис. 9. На фото иммуноферментный автоматический анализатор.

Для первичного обследования групп лиц с целью выявления ВИЧ-инфекции применяется только методика ИФА.

Метод иммуноблотинга

Метод иммуноблотинга является более точным, чем ИФА, по мнению большинства специалистов — эталонным. С его помощью в сыворотке крови обнаруживают антитела к белкам ВИЧ. Методика применяется с целью подтверждения результатов, полученных при проведении ИФА. Обладает высокой специфичностью. Ложноположительные результаты встречаются редко. Достоверность полученных результатов достигает 99%. Иммуноблотинг является дорогостоящей методикой и требует высокой специализации специалиста, проводящего исследование. Возможно получение сомнительных результатов.

Метод основан на разделении антигенов (белков) ВИЧ с применением электрофореза по молекулярной массе. Первыми при инфицировании выявляются антитела против капсидных белков «Gag» (р24 и р17) и прекурсор р55. Вслед за ними появляются антитела против суперкапсидных белков «Env» (гликопротеидов gр 160, gр120, gр41 и белков р88) и неструктурных белков «Pol» (р31, р51 и р66). В ряде случаев могут определяться антитела против генов «vpu», «vpr», «vif», «tat», «nef», «rev», «tat».

Сыворотка крови больных ВИЧ-1 и ВИЧ-2 содержит антитела ко всем белкам вирусов, но для подтверждения диагноза определяются у ВИЧ-1 только антитела к белкам р24, gр41, gр120 и gр160, у ВИЧ-2 — антитела к белкам gр105, gр140 и gр36.

При наличии 2-х положительных результатов с применением ИФА и иммуноблота в одной пробе ставиться диагноз ВИЧ-инфекции.

Иммуноблоттинг на вичиммуноблот вич

Рис. 10. Аппарат для проведения исследования методом иммуноблота.

Иммуноблоттинг на вичиммуноблот

Рис. 11. Диагноз ВИЧ-инфекции ставиться при наличии 2-х положительных результатов с применением ИФА и иммуноблота в одной пробе.

Тест-системы для подсчета СД4-лимфоцитов

Одним из иммунологических тестов, применяемых при ВИЧ-инфекции, является методика подсчета СD4 и СД8-лимфоцитов в крови.

СD4-лимфоциты (Т-хелперы) поражаются вирусами иммунодефицита. Постепенное истощение их популяции приводит к снижению иммунитета и организм больного перестает противостоять инфекции. Подсчет CD4-лимфоцитов осуществляется методом проточной цитометрии с помощью автоматических анализаторов или вручную при оптической или флюоресцентной микроскопии. По количеству СD4-лимфоцитов определяется время начала специфического лечения (антиретровирусной терапии) и профилактики оппортунистических инфекций, оценивается эффективность лечения.

  • При количестве CD4-лимфоцитов в сыворотке крови от 500 и ниже в 1 мл говорит о развитии иммунодефицита.
  • При снижении количества CD4-лимфоцитов до 200 в 1 мл (норма от 600 до 1900 клеток в 1 мл) развивается синдром приобретенного иммунодефицита — СПИД.
  • При снижении уровня CD4-лимфоцитов до 50 и ниже в 1 мкл СПИД переходит в терминальную стадию.

Удельный вес CD4-лимфоцитов среди всех лимфоцитов в норме составляет около 40%. Снижение показателя до 20% говорит о развитии СПИДа.

CD8-лимфоциты (Т-киллеры, на англ. killer — убийца) уничтожают вирусы ВИЧ путем цитолиза. Их пролиферация (увеличение количества) зависит от активности Т-хелперов. При ВИЧ-инфекции количество CD4 и CD8-лимфоцитов уменьшается, но более всего падает уровень CD4-лимфоцитов. Соотношение CD4/ CD8 в норме составляет 1,5 — 2,5. При снижении количества CD4- лимфоцитов отмечается снижение индекса.

Его величина менее 1 говорит о развившемся иммунодефиците, при показателе соотношения 0,6 — 0,8 развивается СПИД.

При получении положительных результатов тестирования человек должен стать на учет в государственное учреждение Центр профилактики и борьбы со СПИД, где будет установлен мониторинг за его состоянием и назначено адекватное специфическое лечение.

Иммуноблоттинг на вичфото анализ вич

Рис. 12. На фото проточные автоматические анализаторы с помощью которых осуществляется подсчет CD4-лимфоцитов в крови исследуемого.

Тест на ВИЧ с применением ПЦР

Все большее распространение в последние годы получает молекулярно-генетический метод диагностики ВИЧ-инфекции — полимеразная цепная реакция (ПЦР). С ее помощью определяется генетический материал возбудителя — РНК уже через 1 — 2 недели после предполагаемого заражения, а высокая чувствительность теста позволяет выявлять РНК вирусов даже если их в исследуемом материале находятся единицы. Данная методика является дорогостоящей и поэтому в настоящее время для скрининга не используется. К тому же значимой проблемой исследования является возможность получения ложноположительных результатов.

Суть методики ПЦР при ВИЧ

Суть данной методики заключается в получении множества копий РНК вируса (нуклеиновой кислоты), в последующем выявляемых как по характерному строению, так и с помощью меченых ферментов или изотопов.

Возможности ПЦР при ВИЧ-инфекции

С помощью ПЦР можно разрешить сомнительные результаты, полученные при применении методики иммуноблотинга, диагностировать ВИЧ-инфекцию на ранних стадиях (уже через 1 — 2 недели после предполагаемого заражения), контролировать эффективность проводимой антиретровирусной терапии, определять стадию заболевания.

Анализы ПЦР рекомендовано сдавать спустя 4 недели от момента предполагаемого риска.

Иммуноблоттинг на вичфото вич

Рис. 13. На фото слева нормальный Т-лимфоцит, справа — Т-лимфоцит, инфицируемый ВИЧ. Видны множественные пузыри, между которыми появились новообразованные вирусы (мелкие округлой формы образования). С помощью ПЦР ВИЧ-инфицированность выявляется уже через 1 — 2 недели после предполагаемого заражения.

Преимущества методики ПЦР при ВИЧ

  • С помощью ПЦР возможно выявить сам вирус и его количество.
  • Возможность использования у детей младше полутора лет.
  • Проводить оценку эффективности лечения.
  • Определить тяжесть и прогноз заболевания.

Недостатки методики ПЦР при ВИЧ

  • Большая стоимость исследования.
  • Наличие специализированных лабораторий.
  • Длительность получения результатов (до 4-х недель).

Кому проводится ПЦР

  1. Получение результата на 7 — 10 день лицам в случае предполагаемого инфицирования, когда желателен результат, полученный в короткие сроки.
  2. Для определения срока начала и оценки эффективности проводимого лечения.
  3. ПЦР проводится инфицированным беременным за 4 недели до родов с целью решения вопроса о применения кесарево сечения.
  4. Новорожденным от инфицированных матерей. Дважды полученный положительный результат свидетельствует о заражении ребенка.

В обычных условиях для скрининга и диагностики ВИЧ-инфекции ПЦР не используется

РНК ПЦР и ДНК ПЦР. В чем разница

  • РНК ПЦР доказывает факт наличия вируса иммунодефицита в крови и объем выявленной РНК. Данное исследование применяется у диагностированных лиц с целью оценки эффективности проводимой терапии.
  • С помощью ДНК ПЦР определяется наличие вируса в мононуклеарных клетках у детей, когда антитела к вирусу иммунодефицита человека у матери мешает использовать методику ИФА.

Вирусная нагрузка

Вирусная нагрузка определяется путем подсчета количества РНК-копий в 1 мл плазмы крови, что позволяет определить стадию заболевания, провести анализ проводимого специфического лечения, определить тяжесть и прогноз заболевания. Чем выше вирусная нагрузка, тем меньше в плазме крови регистрируется CD4-лимфоцитов.

Интерпретация результатов:

  • РНК либо не выявлена, либо число копий РНК менее 20 в 1 мл. плазмы.
  • РНК выявлена на пределе чувствительности — менее 20 копий/мл.
  • РНК от 20 до 106 копий в 1 мл плазмы крови говорит о достоверности результата.
  • РНК-копий более 106мл — верхний предел линейного диапазона.

Увеличение вирусной нагрузки у больного с ВИЧ-инфекцией в три и более раза является клинически значимым результатом.

Контроль над вирусной нагрузкой проводится каждые 3 месяца у больных, лечение которым еще не проводится. В случае начала проведения антиретровирусной терапии контроль осуществляется через 2 — 8 недель.

Иммуноблоттинг на вичпцр вич

Рис. 14. ПЦР в последние годы пользуется все большей популярностью.

Иммуноблоттинг на вичпцр

Рис. 15. Амплификаторы для проведения ПЦР.

Тест на ВИЧ необходимо проводить на ранних сроках инфицирования и периодически при заболевании, что обеспечит своевременное назначение антиретровирусной терапии предупреждение и развития грозных инфекционных и онкологических процессов.

Культивирование вируса

Обнаружить вирусы, его РНК, ДНК, антигены и антитела можно не только в сыворотке крови, но и сперме, слюне, содержимом влагалища и др. Культивируют ВИЧ в культуре клеток лимфоцитов. Методика является высокочувствительной и специфичной (до 100%), однако дороговизна исследования не позволяет его использовать в повседневной лабораторной работе.

Источник: hcv.gepasoft.ru

Общая информация

Иммуноблот – что это такое? Для того чтобы распознать у человека ВИЧ-инфекцию, необходимо пройти метод лабораторного исследования сыворотки крови на присутствие антител. Методику иммуноблоттинга еще называют вестерн-блот (western blot). Ее используют для обнаружения вирусных инфекций человека, как дополнительный экспертный способ. Он необходим для подтверждения ИФА – лабораторного исследования, позволяющего определить в крови наличие ВИЧ-антител. Иммуноблоттингом перепроверяют положительный анализ ИФА. Он считается наиболее чувствительным, сложным и дорогим.

Предназначение

Что это такое – иммуноблот? Это методика лабораторного исследования сыворотки крови на наличие антител к вирусу. Во время проведения исследования специалист предварительно разделяет белки вируса в геле и переносит их на нитроцеллюлозную мембрану. Предназначена процедура иммуноблоттинга для определения ВИЧ на разных стадиях. На первом этапе очищенный вирус от составных частей подвергают электрофорезу, а антигены, входящие в его состав, разделяют по молекулярному весу.

Вирус иммунодефицита человека размножается в живой клетке, встраивая в нее свою генетическую информацию. На этом этапе человек становится носителем вируса ВИЧ, если был заражен. Специфика заболевания в том, что оно долгое время может никак себя не проявлять. Вирус разрушает лимфоциты, поэтому иммунитет человека снижается, и организм становится неспособным противостоять инфекциям. Если ВИЧ грамотно и вовремя лечить, пациент проживет до глубокой старости. Отсутствие терапии неминуемо приводит к летальному исходу. С момента инфицирования, но без лечения, максимальный срок жизни составляет не более десяти лет.

Особенности

Иммуноблот анализ – достоверный метод, который позволяет определить наличие антител к антигенам ВИЧ первого и второго типа. Если человек инфицирован, уже через две недели появляются антитела, которые могут обнаруживаться и намного позднее. Особенность ВИЧ в том, что количество антител быстро увеличивается и сохраняется в крови больного. Даже если они присутствуют, болезнь может не проявлять себя в течение двух и более лет. Метод ИФА не всегда точно определяет наличие заболевания, поэтому требуется подтверждение результатов с помощью иммуноблоттинга и ПЦР, если иммуноферментный анализ показал положительный результат.

Показания к назначению

Что это такое «иммуноблот» уже выяснили, но кому назначают данное исследование? Поводом сдать анализы на вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) методом иммуноблоттинга становится положительный результат ИФА. Необходимо пройти через иммуноферментный анализ пациентам, которые будут оперироваться. Кроме этого, следует сделать анализ женщинам, планирующим беременность, а также всем, кто ведет беспорядочную половую жизнь. Назначают иммуноблоттинг пациентам с ВИЧ, если результаты ИФА вызывают сомнения. Поводом для обращения к врачу могут стать следующие тревожные симптомы:

  • резкое похудение;
  • слабость, потеря работоспособности;
  • расстройство кишечника (диарея), которое продолжается в течение трех недель;
  • обезвоживание организма;
  • лихорадка;
  • увеличение лимфатических узлов на теле;
  • развитие кандидоза, туберкулеза, пневмонии, токсоплазмоза, обострение герпеса.

Пациенту не нужно подготавливаться перед сдачей венозной крови. За 8-10 часов до исследования нельзя принимать пищу. Не рекомендуется за сутки до сдачи крови употреблять алкогольные и кофейные напитки, заниматься тяжелыми физическими упражнениями, испытывать волнение.

Где сделать анализ?

Где можно сдать анализ на ВИЧ? ИФА, иммуноблот исследования проводят в городских частных клиниках, результаты выдают в течение суток. Возможна и срочная диагностика. В государственных медицинских учреждениях анализы ИФА и иммуноблоттинг проводят бесплатно, согласно законодательству РФ. В обязательном порядке проверку на инфекционные заболевания проходят беременные женщины, а также пациенты, которым предстоит госпитализация или оперативное вмешательство.

Как проводится исследование?

Как проводят анализ ИФА? Иммуноблот положительный/отрицательный подтверждает или опровергает результаты иммуноферментного анализа. Процедура исследования достаточно простая. Специалист проводит забор венозной крови, по времени это занимает не более пяти минут. После взятия проб место укола следует дезинфицировать и заклеить пластырем. Забор проводят натощак, поэтому после процедуры не помешает съесть плитку горького шоколада или выпить сладкий горячий напиток.

Для того чтобы получить направление на бесплатный анализ в государственном медицинском учреждении, необходимо посетить врача-терапевта. В целом, иммуноблот не отличается от других исследований крови по способу забора. Методика исследования простая. Если в крови человека присутствует вирус, организм для его разрушения начинает вырабатывать антитела. Для каждого вируса существует свой набор белков-антигенов. Выявление этих антител и есть основа методики иммуноблоттинга.

Стоимость

Сколько стоит анализ? Иммуноблот на ВИЧ не относится к дешевым исследованиям. В среднем, скрининговое обследование иммуноферментными методами стоит от 500 до 900 рублей. Иммуноблоттинг – это верификационное исследование, стоимость которого составляет от трех до пяти тысяч рублей. Более сложные методы стоят намного дороже. Например, за анализ полимеразной цепной реакции (ПЦР) нужно будет заплатить около 12000 рублей.

Трактовка результата

Самые распространенные методы диагностики инфекции ВИЧ – это иммуноферментный анализ и иммуноблот. Они ипользуются для определения в сыворотки крови антител к вирусу иммунодефицита. Наличие инфекции обычно подтверждают двумя тестами: скрининговым и подтверждающим. Интерпретация результатов исследования должна проводиться врачом, он же ставит диагноз и назначает лечение. Если иммуноблот положительный, это означает, что в организме человека присутствует вирус.

Положительный результат не должен стать поводом для самостоятельного лечения, так как у каждого пациента может быть своя картина заболевания. Качественный анализ включает скрининговый и вертификационный. Если у пациента не обнаружен вирус, то в результате указывают «отрицательно». При обнаружении методом скрининга проводят дополнительное вертификационное исследование. Иммуноблот – это анализ, который подтверждает или опровергает скрининг. Если на тест-полоске появляются потемнения на определенных участках (места локализации белков), ставят диагноз «ВИЧ». Если результаты вызывают сомнения, анализы проводят в течение трех месяцев.

Не допустить заражение вирусом иммунодефицита можно, если соблюдать определенные правила: избегайте случайных половых связей, используйте презерватив во время контактов, не принимайте наркотики. Если болезнь обнаружена у беременной женщины, важно четко соблюдать рекомендации лечащего врача, не забывать проходить обследования на предмет наличия вируса.

Источник: FB.ru

52. Интерфероны, природа. Способы получения и применения.

Интерферонотносится к важным защитным белкам иммунной системы. Открыт при изучении интерференции вирусов, т. е. явления, когда животные или культуры клеток, инфициро­ванные одним вирусом, становились нечувствительными к заражению другим вирусом. Оказалось, что интерференция обусловлена образующимся при этом белком, обладаю­щим защитным противовирусным свойством. Этот белок назвали интерфероном.

Интерферон представляет собой семейство белков-гликопротеидов, которые синтезируются клетками иммунной системы и соединительной ткани. В зависимости от того, какими клетками синтезируется интерферон, выделяют три типа: α, β и γ-интерфероны.

Альфа-интерферонвырабатывается лейкоцитами, и он получил название лейкоцитарного;бета-интерферонназывают фибробластным, поскольку он синтезируется фибробластами — клетками соединительной ткани, агамма-интерферон — иммунным, так как он вырабатывается активированными Т-лимфоцитами, макрофагами, естественными киллерами, т. е. иммунными клетками.

Интерферон синтезируется в организме постоянно, и его концентрация в крови де­ржится на уровне примерно 2 МЕ/мл (1 международная единица — ME — это количество интерферона, защищающее культуру клеток от 1 ЦПД50вируса). Выработка интерферона резко возрастает при инфицировании вирусами, а также при воздействии индукторов интерферона, например РНК, ДНК, сложных полимеров. Такие индукторы интерферона получили названиеинтерфероногенов.

Помимо противовирусного действия интерферон обладает противоопухолевой защитой, так как задерживает пролиферацию (размножение) опухолевых клеток, а также иммуномодулирующей активностью, стимулируя фагоцитоз, естественные киллеры, регулируя антителообразование В-клетками, активируя экспрессию главного комплекса гистосовместимости.

Механизм действияинтерферона сложен. Интерферон непосредственно на вирус вне клетки не действует, а связывается со специальными рецепторами клеток и оказывает влияние на процесс репродукции вируса внутри клетки на стадии синтеза белков.

Применение интерферона. Действие интерферона тем эффективнее, чем раньше он начинает синтезироваться или поступать в организм извне. Поэтому его используют с профилактической целью при многих вирусных инфекциях, например гриппе, а также с лечебной целью при хронических вирусных инфекциях, таких как парентеральные гепатиты (В, С, D), герпес, рассеянный склероз и др. Интерферон дает положительные результаты при лечении злокачественных опухолей и заболеваний, связанных с иммунодефицитами.

Интерфероны обладают видоспецифичностью, т. е. интерферон человека менее эффективен для животных и наоборот. Однако эта видоспецифичность относительна.

Получение интерферона. Получают интерферон двумя способами: а) путем инфицирования лейкоцитов или лимфоцитов кро­ви человека безопасным вирусом, в результате чего инфицированные клетки синтезируют интерферон, который затем выделяют и конструируют из него препараты интерферона; б) генно-инженерным способом — путем выращивания в производственных условиях рекомбинантных штаммов бактерий, способных продуцировать интерферон. Обычно используют рекомбинантные штаммы псевдомонад, кишечной палочки со встроенными в их ДНК генами интерферона. Интерферон, полученный генно-инженерным способом, носит название рекомбинантного. В нашей стране рекомбинантный интерферон получил официальное название «Реаферон». Производство этого препарата во многом эффективнее и дешевле, чем лейкоцитарного.

Рекомбинантный интерферон нашел широкое применение в медицине как профилактическое и лечебное средство при вирусных инфекциях, новообразованиях и при иммунодефицитах.

Источник: studfile.net

Иммунный блоттинг (иммуноблот, Western Blot, вестерн-блот) — сочетает в себе иммуноферментный анализ (ИФА) с предварительным электрофоретическим переносом на нитроцеллюлозную полоску (стрип) антигенов вируса.

В этом красивом ученом названии «blot» переводится скорее всего как «клякса», а «western» — как « западная» отражает направление распространения этой «кляксы» по бумаге слева направо, то есть на географической карте это соответствует направлению с запада на восток.». Суть метода «иммунный блот» заключается в том, что иммуноферментную реакцию проводят не со смесью антигенов, а с антигенами ВИЧ, предварительно распределенными методом иммунофореза по фракциям, располагающимся согласно молекулярному весу по поверхности нитроцеллюлозной мембраны. В результате основные белки ВИЧ, носители антигенных детерминант, распределяются по поверхности в виде отдельных полос, которые и проявляются при проведении иммуноферментной реакции.

Иммуноблот включает в себя несколько стадий:

Подготовка стрипа. Предварительно очищенный и разрушенный до составных компонентов вирус иммунодефицита (ВИЧ) подвергается электрофорезу, при этом входящие в состав ВИЧ антигены разделяются по молекулярному весу. Затем методом блоттинга (аналог выдавливания на «промокашку» избытка чернил) антигены переносят на полоску нитроцеллюлозы, которая отныне содержит невидимый пока глазом спектр антигенных полос, характерный для ВИЧ.

Исследование пробы. На нитроцеллюлозную полоску наносится исследуемый материал (сыворотка, плазма крови пациента и т.п.), и если в пробе есть специфические антитела, то они связываются со строго соответствующими им (комплиментарными) антигенными полосами. В результате последующих манипуляций результат этого взаимодействия визуализируется — делается видимым.

Трактовка результата. Наличие полос в на определённых участках нитроцеллюлозной пластины подтверждает присутствие в исследованной сыворотке антител к строго определённым антигенам ВИЧ.

В настоящее время иммунный блоттинг (иммуноблот) является основным методом для подтверждения наличия вирусспецифических антител в исследуемой сыворотке. В некоторых случаях ВИЧ-инфекции, до развития сероконверсии, специфические антитела более эффективно выявляются методом иммунного блоттинга, чем ИФА. При исследовании методом иммунного блоттинга обнаружено, что чаще всего в сыворотках больных СПИДом выявляются антитела к gp 41, причем обнаружение р24 у лиц, обследуемых с профилактической целью, требует дополнительных исследований на наличие у них ВИЧ-инфекции. Тест-системы для иммунного блоттинга на основе рекомбинантных белков, полученных путем генной инженерии, оказались более специфичными, чем обычные системы на основе очищенного вирусного лизата. При использовании рекомбинантного антигена формируется не диффузная, а четко выраженная узкая полоска антигена, легко доступная для учета и оценки.

Сыворотки лиц, инфицированных ВИЧ-1, обнаруживают антитела к следующим основным белкам и гликопротеидам — структурным белкам оболочки (env) — gp160, gp120, gp41; ядра (gag) — p17, p24, p55, а также ферментов вируса (pol) — p31, p51, p66. Для ВИЧ-2 типичны антитела к env — gp140, gp105, gp36; gag — p16, p25, p56; pol — p68.

Среди лабораторных методов, необходимых для установления специфичности реакции, наибольшее признание имеет обнаружение антител к белкам оболочки ВИЧ-1- gp41, gp120, gp160, и ВИЧ-2 — gp36, gp105, gp140.

ВОЗ считает положительными сыворотки, в которых методом иммунного блотинга обнаруживаются антитела к каким-либо двум гликопротеидам ВИЧ. Согласно этим рекомендациям, при наличии реакции только с одним из белков оболочки (гп 160, гп 120, гп 41) в сочетании или без реакции с другими белками, результат считается сомнительным и рекомендуется повторное исследование, используя набор другой серии или другой фирмы. Если и после этого результат остается сомнительным, рекомендуется наблюдение в течение 6 месяцев (исследования через 3 месяца).

Наличие положительной реакции с антигеном p24 может указывать на период сероконверсии, так как антитела именно к этому белку иногда появляются первыми. В этом случае рекомендуется, в зависимости от клинических и эпидемиологических данных, повторить исследование с образцом сыворотки, взятым как минимум через 2 недели, и это является как раз тем случаем, когда при ВИЧ-инфекции необходимо исследование парных сывороток.

Положительные реакции с белками gag и pol без наличия реакции с белками env могут отражать стадию ранней сероконверсии, а также может указывать на ВИЧ-2 инфекцию или на неспецифическую реакцию. Лиц с такими результатами после тестирования на ВИЧ-2 повторно исследуют через 3 месяца (в течение 6 месяцев).

Источник: www.eurolab-portal.ru


You May Also Like

About the Author: admind

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Этот сайт использует Akismet для борьбы со спамом. Узнайте, как обрабатываются ваши данные комментариев.