Клетки мишени для вич


Андрей Взоров
«Природа» №10, 2018

Нелишним будет напомнить, что вирус иммунодефицита человека (ВИЧ, или HIV, от англ. human immunodeficiency virus) относится к роду лентивирусов (Lentivirus) семейства ретровирусов (Retroviridae). Несмотря на кодирование только 15 зрелых белков, ВИЧ-1 (самый распространенный тип ВИЧ) может вызывать персистентную форму инфекции у людей, при этом избегать врожденных и адаптивных иммунных ответов. Наиболее важная характеристика иммунобиологии ВИЧ и SIV (от англ. simian immunodeficiency virus — ‘вирус иммунодефицита обезьян’) — скорость и динамичность этих вирусов. Несмотря на то что их групповое название рода происходит от латинского слова lente (‘медленный’) и дано на основе медленного клинического проявления инфекции, лентивирусы способны быстро создать большую генетически гибкую адаптивную вирусную популяцию до появления эффективного противовирусного иммунитета и, как следствие, могут быстро образовывать вирусные варианты в ответ на селективное давление окружающей среды. Эта стратегия почти всегда дает вирусу возможность быть на шаг впереди эффективного иммунного ответа.


Сферической формы частица ВИЧ диаметром 100–180 нм окружена клеточной двуслойной мембраной, под которой находится матриксный белок и конической формы белковый капсид, содержащий две молекулы РНК и ферменты, обеспечивающие размножение вируса в клетке.

Внутри вириона и на поверхности его мембраны находятся белки, часть которых кодируется девятью вирусными генами, а часть, как и сама мембрана, захватывается из хозяйской клетки. Мембранные белки ВИЧ нужны, чтобы вирусная частица могла взаимодействовать с рецепторами клеток-мишеней, после чего мембраны вириона и клетки сливаются, а его содержимое попадает внутрь ее цитоплазмы. ВИЧ интегрирует свои гены в клеточный геном и вызывает латентную форму инфекции.

ВИЧ поражает в основном клетки иммунной системы, которые несут рецепторы CD4 (CD+-клетки). В ранних исследованиях, в которых молекулу CD4 идентифицировали в качестве рецептора ВИЧ и SIV, развитие синдрома приобретенного иммунного дефицита (СПИД) объяснялось потерей CD4+ Т-клеток. Сокращение этой субпопуляции иммунных клеток может привести к недостаточным антивирусным иммунным ответам, которые будут способствовать устойчивой вирусной репликации и утрате иммунного контроля.


нако на самом деле первоначальные адаптивные иммунные ответы (в частности CD8+ Т-клеток) на ВИЧ-инфекцию достаточно сильны. Это свидетельствует о том, что плохой адаптивный иммунный контроль над ВИЧ-инфекцией не может быть следствием потери CD4+ T-клеток. Более того, ВИЧ целенаправленно воздействует на врожденный иммунитет, включая свои вирусные гены vpu и vif, которые противодействуют клеточным антивирусным белкам — тетерину и APOBEC3G (от англ. apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptidelike 3G) соответственно.

На фоне прогрессирующей ВИЧ-инфекции и развивающегося СПИДа организм больного теряет возможность защищаться, возникают вторичные оппортунистические заболевания, которые без адекватного лечения приводят к смерти. По оценкам Всемирной организации здравоохранения, со времени открытия ВИЧ в мире заразилось более 70 млн человек, из которых более половины — умерли. В конце 2017 г. было зарегистрировано почти 37 млн инфицированных ВИЧ, из них более 1,2 млн — россияне.

Единственный доступный сейчас вид лечения ВИЧ-инфекции / СПИДа — высокоактивная антиретровирусная терапия, которая должна проводиться пожизненно, поскольку не избавляет больного от вируса. Решить эту проблему может лишь разработка эффективных вакцин и методов профилактики ВИЧ. В отличие от традиционных противовирусных вакцин, которые препятствуют развитию болезни, но позволяют инфекции начаться, вакцина против ВИЧ должна полностью ее предотвращать. Иными словами, для профилактики ВИЧ-инфекции необходимо наличие нейтрализующих антител, которые блокируют проникновение вируса в клетки.


Самая важная и критическая мишень для адаптивных иммунных реакций — шипы на вирусной частице, образованные гликопротеином Env (от англ. envelope protein), который состоит из двух субъединиц: вариабельного белка gp120, обладающего функцией связывания с рецептором, и более консервативного трансмембранного gp41, удерживающего в мембране молекулу gp120 и опосредующего слияние с клеточной мембраной (рис. 1). Функциональные сайты шипов защищены от иммунной системы хитроумными вирусными механизмами, обойти которые пока не удается, поэтому эффективной вакцины, создающей протективный иммунитет против ВИЧ-инфекции, до сих пор не существует. Поверхностный гликопротеин Env вирус использует для проникновения в определенные клетки (тропизм), взаимодействуя с их специфическими рецепторами (CD4, CCR5, CXCR4). Возможность изменения тропизма ВИЧ во время инфекции обеспечивается биологическими свойствами Env — большой гибкостью и изменчивостью этого белка.

Биологические свойства Env


На начальных стадиях инфекции гликопротеин Env всех ретровирусов, связываясь с поверхностными клеточными рецепторами, способствует проникновению вириона в клетку путем мембранного слияния, на поздних — участвует в вирусной сборке [1]. Кроме того, есть доказательства внутриклеточного взаимодействия Env с матриксным белком, с клеточными белками, ассоциированными с мембранным микродоменом (липидным рафтом), а также прямого влияния гликопротеина на участок сборки и почкования вирусных частиц в поляризованных эпителиальных клетках [1, 2].

У лентивирусов, в отличие от других ретровирусов, Env содержат необычно длинный домен — цитоплазматический хвост (CT, от англ. cytoplasmic tail) из приблизительно 150–200 аминокислотных остатков (а.о.). Хвост трансмембранного белка может стать короче из-за досрочной остановки его синтеза, что используется ВИЧ или SIV как потенциальный механизм адаптации к новым типам клеток или ускользания от ингибиторов, блокирующих проникновение вирусов в клетки. Вирусные частицы с коротким СТ дефектны на ранних этапах репликации, после проникновения вируса в клетки [1]. Для поддержки их инфекционности нужна более высокая множественность при заражении, чем для вируса с полноразмерным СТ (для заражения клетки достаточно одной вирусной частицы с полноразмерным СТ).


nbsp;полезным свойствам короткого белка Env для вирусной популяции относится способность заражать больше видов клеток-мишений. Это связано с повышенной способностью короткого белка Env к мембранному слиянию. Полноразмерный цитоплазматический хвост содержит множественные мотивы, включая три высококонсервативные α-спиральные лентивирусные литические пептидные домены (LLP, от англ. lentivirus lytic peptide) — LLP-1, LLP-2 и LLP-3 (см. рис. 1), которые взаимодействуют с клеточной мембраной, снижают ее стабильность и проницаемость для ионов, а также влияют на патогенность (цитопатичность) вируса. Весь этот уникальный набор молекулярных механизмов Env-тримеров, из которых состоят шипы ВИЧ, нужен вирусной частице, повторю, для возможности проникать в клетки и заражать их разные популяции. На функциональной пластичности Env основано большое разнообразие иммуновариантов ВИЧ.

Как известно, ВИЧ обычно передается половым путем через слизистые (мукозные) оболочки, оснащенные мощными средствами защиты — различными лимфоидными клетками. В начале инфекции Env имеет компактную форму с короткими вариабельными петлями, при этом он остается белком высокопатогенного (трансмиссивного) штамма вируса-основателя. Именно эти свойства Env-тримера помогают вирусу эффективно преодолевать мукозный барьер. Таким образом ВИЧ удается ускользать от клеток иммунной системы и быть устойчивым (резистентным) к γ-интерферону, который обязан сдерживать распространение вируса. Дендритные клетки, которые должны предъявлять иммунной системе чужеродные антигены, хоть и эффективно захватывают вирусные частицы, но тем самым лишь ускоряют их перенос к клеткам-мишеням, поскольку ВИЧ при этом умудряется сохранить неизменное (интактное) состояние.


В процессе инфекции ген env, кодирующий gp120 и gp41, меняется так, чтобы вирус получил возможность взаимодействовать с рецепторами и корецепторами определенных клеток-мишеней. ВИЧ размножается (реплицируется) в активированных CD4+ Т-клетках, а чтобы проникнуть в них, использует высокий уровень поверхностного рецептора CD4 и корецептора CCR5. На поздних стадиях инфекции у примерно 50% людей, заразившихся ВИЧ-1, шипы Env переключаются на CXCR4-корецепторы, позволяя вирусам проникать в другие популяции иммунных клеток (В- и Т-лимфоциты, дендритные клетки, моноциты). Так, CD4-независимый ВИЧ начинает реплицироваться в популяциях клеток с низким содержанием CD4+ (макрофагах) или даже вовсе без них — в клетках микроглии в головном мозге, что вызывает неврологические расстройства у примерно 10% ВИЧ-инфицированных.

Включение Env в оболочку частиц при их сборке происходит в несколько этапов.


ачала субъединица gp41 взаимодействует с мембранным белком Rab11-FIP1C (от англ. Rab11 family interacting protein С1), а затем с матриксным белком Gag (от англ. group antigen), который формирует так называемую решетку длинного диапазона (англ. longrange lattice), захватывающую белки Env, что предотвращает их эндоцитоз и создает условия для размещения длинного домена gp41, а значит гарантирует включение Env в вирион [3]. Однако в случае мутаций гена, кодирующего этот домен, таких гарантий не будет, и тут преимущества короткого CT становятся очевидны: он способен преодолеть отсутствие специфического взаимодействия Env с матриксным белком (возможно, спасение Env связано со снятием стерического столкновения между Gag и CT). В результате эксперимента было установлено, что частицы ВИЧ-1 способны включать в оболочку белки Env различных вирусов, чьи гликопротеины имеют короткие цитоплазматические хвосты [4]. Для изучения процесса сборки частиц SIV, на каждой из которых от 15 до 130 шипов, и сравнения включения полноразмерного и усеченного белков Env была использована рекомбинантная экспрессионная система вируса осповакцины. Оказалось, что белки Env с коротким CT-доменом длиной 3 или 17 а.о. (СТ-3 или СТ-17) встраиваются в мембрану и высвобождаются из клеток в составе вирусоподобных частиц (VLP, от англ.

>virus-like particle) в 10 раз эффективнее, чем полноразмерный Env длиной 165 а.о. (рис. 2). Кроме того, белки Env с укороченным CT способны группироваться на поверхности клеток, причем собираются в плотно упакованную структуру (плотнее, чем образуемая полноразмерным Env), что, видимо, способствует интенсивному включению белков Env с короткими CT в состав VLP [5]. С помощью электронного микроскопа на вирусоподобных частицах идентифицирован слой шипов, который заметно выше на частицах с усеченным CT (рис. 2, а), чем на частицах с полноразмерным Env (рис. 2, б). Аналогичные результаты получены для SIV с укороченными / полноразмерными белками Env.

На протяжении многих лет считалось, что белки поверхностных шипов, необходимые для развития инфекции, включаются в вирионы посредством прямого взаимодействия между их CT-доменами и так называемыми кор-компонентами (матричными и капсидными белками) вируса. Однако позднее выяснилось, что это условие не распространяется на ретровирусы: РНК-вирусы могут накапливаться и в отсутствие белков шипов, достаточно наличия лишь вирусных кор-компонентов [6]. Это оказалось полезным для получения VLP (неинфекционных ретровирусоподобных частиц, имитирующих морфологию естественно циркулирующих вирионов), в состав которых обычно входит только полипротеин Gag, но можно включать и разные Env [6]. Важно, что использование VLP в качестве антигена усиливает первичный иммунный ответ.


Получен еще один интересный результат: размер СТ-домена гликопротеина Env вируса SIV может влиять на трехмерную структуру (конформацию) внешнего домена трансмембранной субъединицы [7]. При использовании непроницаемого для мембран реагента биотинилирования белков Env SIVmac239, с полноразмерным или усеченным CT на клеточных поверхностях с последующей иммунопреципитацией, в условиях, при которых на поверхности CD4+— или CD4— клеток выявляли только усеченные варианты белка, полноразмерный gp41 обнаружить не удавалось. В то же время с помощью мембранно-непроницаемого реагента с радиоактивным йодом для мечения белков на поверхности клеток обнаруживали как gp41 полной длины, так и его усеченные варианты. Разницы в обнаружении поверхностных субъединиц, gp120, полноразмерных или усеченных белков не наблюдалось [8]. Эти результаты показали, что укорочение цитоплазматического домена гликопротеина оболочки SIV изменяет конформацию внешнего домена белка gp41. От длины СТ-домена зависят очень важные биологические характеристики SIV — активность репликации и чувствительность к нейтрализующим антителам [9]. Именно различная конформация белка Env, обусловленная длиной СТ, по-видимому, определяет различия в фенотипах вирионов SIV (например, чувствительный к нейтрализации фенотип имеет короткий СТ, а резистентный к нейтрализации — полноразмерный).


В процессе эволюции у оболочечных вирусов для мембранного слияния сформировался механизм, использующий энергию от необратимой модификации (рефолдинга) гликопротеинов Env: белки сначала образуют метастабильную форму, которая затем подвергается каскаду жестко регулируемых конформационных изменений, высвобождая белки, индуцирующие слияние в более низкое энергетическое состояние. Этот механизм для вирусного слияния — одноразовый, он не требует АТФ в качестве источника энергии. Специальные исследования (конформационная фиксация лигандами, такими как молекулы CD4 или имитирующие CD4 антитела, и термодинамический анализ взаимодействий в gp120) показали тенденцию этой внешней субъединицы ВИЧ-1 к принятию CD4-связанной конформации, которая сдерживается V1–V2- и V3-вариабельными петлями gp120. Другими словами, на поверхности вирусной частицы Env-тример находится в метастабильном состоянии, т.е. квазиустойчивом равновесии, в котором система может находиться длительное время благодаря сдерживающим факторам (V1, V2 и V3). Это напоминает сжатую пружину. Показано, что из такого метастабильного состояния Env-тример легко выходит и образует стабильную форму при связывании с CD4-рецептором. Именно при стабилизации Env-тримера открываются консервативные сайты (закрытые у метастабильной формы), или эпитопы для нейтрализующих антител. Однако многочисленные попытки получения открытых форм Env-тримеров путем удаления V1–V2-петель ни к чему не привели. Были получены Env-тримеры с искусственной конформацией, индуцирующей неспецифический иммунный ответ. Прорывными оказались исследования, в которых было показано, что изменения в аминокислотной последовательности трансмембранной субъединицы Env опосредованно влияли на функциональные свойства gp120 [6–9]. Если представить Env-белок в форме зонтика, то изменения в его ручке (gp41) отражаются на форме его купола (gp120). Амфипатическая последовательность LLP-2 в цитоплазматическом хвосте gp41 изменяла клеточный тропизм ВИЧ-1, модулируя специфичность вирусного рецептора, который распознается поверхностной субъединицей gp120 (см. рис. 1) [10]. Таким образом, эти исследования показали, что специфическая последовательность в СТ-домене опосредованно влияет на функциональные области в поверхностной субъединице ВИЧ-1.

Более того, другое исследование доказывало, что СТ-домены могут индуцировать конформационные изменения в функциональных областях gp120 и модулировать тропизм рецептора, но не изменяют специфичность корецептора ВИЧ-1 [11]. Изменения в СТ-домене могут существенно влиять на функцию рецепторсвязывающих сегментов в gp120 и раскрывать сайты, связывающие корецептор в модифицированных белках Env. Так, было впервые продемонстрировано, что с помощью модификации в СТ-домене можно получить «открытые» формы Env-тримера с CD4-связанной конформацией.

Механизмы ускользания Env от иммунных ответов

Как только Env-тримеры достигают мембраны клетки (в которой они синтезируются), Env подвергается эндоцитозу через свои мотивы Y712SPL и L855L856 в цитоплазматическом домене, которые взаимодействуют с комплексом клеточных адаптерных белков AP-1 и AP-2. Поверхностная экспрессия белка Env, а также его стабильность на поверхности клеток повышались при мутации Tyr (Y710S) остатка YXXA мотива в СТ-домене. При анализе CD8 Т-клеточных иммунных ответов у иммунизированных мышей эффекта на мутацию Tyr остатка не наблюдалась. Однако мутантные Env индуцировали более значительные уровни ответов специфических антител. Регуляция поверхностной клеточной экспрессии (уровень на клеточной поверхности уменьшается, при этом экспрессия гена, кодирующего Env белок, не изменяется) белка Env сигналами эндоцитоза в СТ-домене может служить стратегией ускользания ВИЧ от иммунной системы [11].

На поверхности вириона ВИЧ-1 выставляется всего около 7–14 шипов (Env). Столь небольшое их количество необычно для оболочечных вирусов: например, у вируса гриппа их до 400–500 шипов, у вируса везикулярного стоматита — примерно 1200, у вируса саркомы Роуса — до 118 шипов, у вируса лейкемии мыши — около 100. Недостаток шипов на ВИЧ-1 может быть адаптацией и ускользанием от гуморального иммунитета путем ограничения мультивалентного взаимодействия с рецепторами В-клеток и, как следствие, снижения ответа В-клеток, а также предотвращения двухвалентного связывания с антителами, которое в противном случае могло усиливать нейтрализацию антителами (рис. 3). Надо пояснить, что антитела класса IgG имеют два идентичных антигенсвязывающих сайта. В случае распознавания повторяющихся эпитопов, обнаруженных на поверхностях вирусных частиц (множественное включение шипов в оболочку ВИЧ), бивалентность IgG способствует повышению энергии связывания (аффинности).

Клеточные белки или Env с различными СТ-доменами могут быть включены в частицы ВИЧ, что полезно вирусу для защиты от иммунного ответа: у него появляется возможность прикрепляться к различным клеткам-мишеням посредством разнообразных белков Env и за счет приобретенных клеточных белков. Несмотря на частичное нарушение взаимодействия между белками Env и Gag, короткие формы белка Env влияют на сборку вирусных частиц. Укороченный СТ-домен белка Env вируса SIV влияет на включение клеточных и чужеродных вирусных белков в вирусную оболочку. Обычно короткие белки Env встраиваются в частицы и за счет стерического взаимодействия вытесняют включение клеточных и гетерологичных белков, которые содержатся в вирионах с полноразмерным белком Env [11]. Именно состав поверхностных мембранных белков и их свойства определяют фенотипы вирусных частиц.

Во время инфекции ВИЧ-1 нефункциональные белки Env — нерасщепленные или дефектные тримеры, диссоциированные мономеры gp120, промежуточные формы gp41 и продукты деградации белка Env, которые преимущественно экспонируют иммунодоминантные эпитопы для не нейтрализующих антител (non-NAbs, от англ. non-neutralizing antibodies) на поверхности ВИЧ, — также вызывают образование антител (см. рис. 3) [12, 13]. Это еще один механизм ускользания ВИЧ, и нефункциональные формы Env служат для отвлечения внимания B-клеток от тримеров. Ответ антител по отношению к каждому из чужеродных антигенов на поверхности частиц зависит от их относительной доступности для связывания с антителами. Таким образом, высокая доступность нефункциональных форм Env может объяснить их очевидное иммунное доминирование. Антитела, которые реагируют на мономеры (gp120/gp41 или gp41), не вступают в реакцию с тримером, вероятно, потому, что их эпитопы находятся на другой легко доступной поверхности шипа Env.

Кроме того, на поздних стадиях инфекции, чаще всего, Env-шип имеет «ослабленную» конформацию: на фоне развития иммунодефицита у него снижается резистентность, он выставляет на поверхности дополнительные эпитопы для нецелевых иммунных ответов, которые также блокируют образование нейтрализующих антител [8, 9, 11].

Оболочечный белок Env ВИЧ — наиболее N-гликозилированный белок из всех известных поверхностных вирусных гликопротеинов. Один из главных механизмов ускользания ВИЧ от иммунного ответа — интенсивное и многоступенчатое гликозилирование тримера Env (см. рис. 3) [14]. Его предшественник — gp160 — синтезируется в эндоплазматическом ретикулуме, где он гликозилируется и олигомеризуется в тримеры. Олигомеризация обеспечивает доставку gp160-тримеров в аппарат Гольджи, где в ходе процессинга гликанов боковые цепи олигосахаридов с высоким содержанием маннозы приобретают различные комплексные модификации. Однако олигомеризация Env в тримеры создает труднодоступные места, в которых последующий процессинг высокоманозных гликанов затруднен. В связи с тем, что именно в труднодоступных областях Env находятся чувствительные к нейтрализации эпитопы, высокоманозные гликаны еще больше осложняют их распознавание антителами. Получены доказательства, что гликозилирование маскирует антигенные участки на Env-шипе. Расщепление Env-тримеров клеточной протеазой фурином в аппарате Гольджи образует структуру гликопротеинов gp120—gp41. Некоторые нейтрализующие антитела широкого спектра могут распознавать N-связанные гликаны в высокоманозных участках Env-белка. Однако в связи с тем, что гликозилирование белка Env зависит от типа продуцирующих клеток и может изменяться в течение хронической ВИЧ-инфекции, такие антитела не обладают широкой нейтрализующей активностью [15]. Это также осложняет разработку вакцин, в которых в качестве антигена используется нативный Env-белок. Такие вакцинные препараты будут индуцировать гликанзависимые антитела, неэффективные для профилактики ВИЧ-инфекции.

Белок Env способен изменять свою собственную антигенность как в процессе слияния с клеточной мембраной, так и во время инфекции (см. рис. 3). Стратегией ускользания ВИЧ от иммунной системы является не только труднодоступность консервативных эпитопов, но и Env-шип, который сам по себе служит движущейся мишенью для антител (рис. 4). Для наблюдений за конформационными переходами нативных Env-шипов на поверхности вирионов ВИЧ-1 в режиме реального времени был использован одномолекулярный перенос энергии резонанса флуоресценции [16]. Изоляты ВИЧ представляют Env-шипы на поверхности вирионов в конформационной динамике от закрытых до ослабленных конформаций. В зависимости от вида изолята преобладает та или иная конформация. Например, для первичных изолятов характерна закрытая конформация. Белки с закрытой конформацией вызывают образование нейтрализующих антител широкого спектра действия. Для лабораторно-адаптированных изолятов ВИЧ характерна динамика из трех конформаций: закрытой, промежуточной и ослабленной (см. рис. 4).

Взаимодействие с иммунной системой и резистентность ВИЧ

ВИЧ-инфекция вызывает мощные клеточные и гуморальные иммунные ответы. Однако поразительная особенность заключается в том, что иммунная система человека не способна установить эффективный иммунный контроль. Сильные клеточные и гуморальные иммунные ответы не устраняют ВИЧ-инфекцию, более того, даже не способны эффективно контролировать вирусную репликацию. Лентивирусы, вызывающие СПИД у людей и азиатских «нечеловекообразных» приматов (NHP, от англ. nonhuman primates — все приматы, кроме человека), происходят из эндемичных SIV, которые у своих хозяев — африканских NHP — обычно не вызывают заболевания. Отсутствие патогенности не обусловлено способностью этих естественных хозяев иммунологически контролировать репликацию SIV, а скорее всего обусловлено их способностью к адаптации, которая предотвращает неблагоприятное воздействие высокой вирусной репликации на иммунную систему [17]. Это контрастирует с подавляющим большинством вирусных патогенов, для которых иммунный контроль репликации играет главнейшую роль в предотвращении патогенных последствий (в том числе даже персистентных вирусов, таких как вирусы семейства герпесвирусов).

Нельзя сказать, что иммунная система поздно реагирует на ранние события ВИЧ-инфекции. Более того, наблюдается ранний интенсивный цитокиновый шторм. Однако при острой инфекции ВИЧ-1 он имеет иммунопатологические последствия, стимулирует иммунную активацию, репликацию вируса и утрату CD4+ Т-клеток [18]. Это происходит после двух недель инфекции при распространении ВИЧ в лимфатических тканях. Интересно, что в течение той же фазы при инфекции, вызванной вирусом гепатита В, наблюдается сравнительно небольшое отклонение в уровнях цитокинов в плазме, а при остром гепатите C — отсроченный ответ средней величины. Это указывает на то, что быстрая активация системного цитокинового каскада не может считаться необходимым условием для удаления вируса. В начале инфекции противовирусные ответы антител также очень сильны (рис. 5), тем не менее дальнейшие события показывают их неэффективность в защите от развития заболевания. Аутогенные нейтрализующие антитела вырабатываются в ответ на Env-тример трансмиссивного штамма основателя ВИЧ. Эти антитела ингибируют трансмиссионный вирус, но в тоже время вызывают появление ускользающих мутаций в Env-тримере и образование нового иммунного варианта ВИЧ (см. рис. 5). В результате формируются нейтрализующие антитела, которые ингибируют этот вариант ВИЧ, но стимулирует ускользающие мутации в Env-тримере. Эта ситуация повторяется многократно. В конце концов нейтрализующие антитела широкого спектра действия возникают как результат экстенсивных соматических гипермутаций иммунных клеток. Через два-три года после начала инфекции нейтрализующие антитела широкого спектра действия (bNAbs) вырабатываются у 10–30% пациентов с хронической формой ВИЧ-инфекции, но они неэффективны у этих пациентов. У большинства инфицированных антивирусные CD8+ Т-клеточные ответы также неэффективны. Это происходит даже в том случае, если ответы нацелены на вирусные варианты без видимых дефектов и не связаны с мутациями в последовательностях. Таким образом, CD8+ Т-клеточные ответы не могут достичь высокого уровня эффекторной реакции к эпитопам-мишеням для воздействия на репликацию вируса.

Механизмы дифференцировки Т-клеток памяти имеют основополагающее значение для иммунопатогенеза ВИЧ [19]. Поскольку ВИЧ является CCR5-тропным, дифференцировка Т-клеток памяти обеспечивает ВИЧ мишеням эффекторные CD4+ клетки памяти, которые только на поздних стадиях дифференцировки синтезируют высокий уровень CCR5, чувствительны для ВИЧ, при этом популяция их предшественников, центральные Т-клетки памяти благодаря низкому содержанию CCR5 защищены от ВИЧ-инфекции. Где у ВИЧ «ахиллесова пята»? Все больше доказательств того, что ранняя стадия передачи ВИЧ уязвима для иммунного вмешательства. «CCR5-тропизм» фокусирует ВИЧ/SIV инфекцию на дифференцированных CD4+ эффекторных Т-клетках памяти. Напомню, эффекторные CD4+ Т-клетки памяти — это пополняемый резервуар потенциальных клеток-мишеней для ВИЧ. Пациенты, которым были пересажены трансплантаты костного мозга от доноров, не имеющих одной или обеих копий полноразмерного CCR5, демонстрировали длительные ремиссии без обнаружения признаков инфекции ВИЧ-1. «Окно возможностей» — это самый ранний период от начала заражения, когда иммунные ответы, вызванные вакциной, которая нацелена на индукцию Т-клеточных ответов, способны перехватывать развивающуюся инфекцию. Т-клеточная вакцина, которая вводится в режиме prime-boost*, сокращает время получения пика эффекторных ответов, но эти ответы развиваются после «окна возможностей» и не предотвращают необратимую системную инфекцию. Напротив, персистентные цитомегаловирусные векторы, непрерывно продуцирующие высокочастотные эффекторные ответы в пределах «окна возможностей», способны подавлять инфекцию. Однако вакцины Т-клеточной направленности не могут полностью предотвращать развитие ВИЧ-инфекции в связи с тем, что не способны блокировать проникновение вируса в клетку. Инфекция развивается после окончания действия таких векторов.

Многочисленные механизмы ускользания ВИЧ от иммунной системы, связанные с Env-тримерами, и отсутствие прецедента естественного иммунитета, ведущего к удалению ВИЧ и устойчивой иммунной защите от суперинфекции, указывают на то, что разработка эффективной вакцины против ВИЧ/СПИДа потребует разработки новых иммуногенов, вызывающих защитный иммунный ответ против ВИЧ, который не смогла создать природа. Новым подходам к созданию такой вакцины будет посвящена следующая статья — в ноябрьском номере «Природы».

Литература
1. Vzorov A. N., Weidmann A., Kozyr N. L. et al. Role of the long cytoplasmic domain of the SIV Env glycoprotein in early and late stages of infection // Retrovirology. 2007; 4: 94. DOI: 10.1186/1742-4690-4-94.
2. Owens R. J., Compans R. W. Expression of the human immunodeficiency virus envelope glycoprotein is restricted to basolateral surfaces of polarized epithelial cells // J. Virol. 1989; 63(2): 978–982.
3. Tedbury P. R., Novikova M., Ablan S. D., Freed E. O. Biochemical evidence of a role for matrix trimerization in HIV-1 envelope glycoprotein incorporation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2016; 113(2): E182–E190. DOI: 10.1073/pnas.1516618113.
4. Chertova E., Bess J. W., Jr. et al. Envelope glycoprotein incorporation, not shedding of surface envelope glycoprotein (gp120/SU), Is the primary determinant of SU content of purified human immunodeficiency virus type 1 and simian immunodeficiency virus // J. Virol. 2002; 76(11): 5315–5325. DOI: 10.1128/JVI.76.11.5315-5325.2002.
5. Vzorov A. N., Compans R. W. Assembly and release of SIV env proteins with full-length or truncated cytoplasmic domains // Virology. 1996; 221(1): 22–33. DOI: 10.1006/viro.1996.0349.
6. Взоров А. Н., Тенцов Ю. Ю., Григорьев В. Б. и др. Образование вирусоподобных частиц белков Gag ВИЧ-1, экспрессируемых рекомбинантным вирусом осповакцины // Молекулярная биология. 1990; 24(6): 1666–1674.
7. Spies C. P., Ritter G. D., Jr. et al. Truncation of the cytoplasmic domain of the simian immunodeficiency virus envelope glycoprotein alters the conformation of the external domain // J. Virol. 1994; 68(2): 585–591.
8. Vzorov A. N., Compans R. W. Effect of the cytoplasmic domain of the simian immunodeficiency virus envelope protein on incorporation of heterologous envelope proteins and sensitivity to neutralization // J. Virol. 2000; 74(18): 8219–8225. DOI: 10.1128/JVI.74.18.8219-8225.2000.
9. Vzorov A. N., Gernert K. M., Compans R. W. Multiple domains of the SIV Env protein determine virus replication efficiency and neutralization sensitivity // Virology. 2005; 332(1): 89–101. DOI: 10.1016/j.virol.2004.10.044.
10. Vzorov A. N., Yang C., Compans R. W. An amphipathic sequence in the cytoplasmic tail of HIV-1 Env alters cell tropism and modulates viral receptor specificity // Acta Virol. 2015; 59(3): 209–220. DOI: 10.4149/av-2015-03-209.
11. Ye L., Bu Z., Vzorov A. et al. Surface stability and immunogenicity of the human immunodeficiency virus envelope glycoprotein: role of the cytoplasmic domain // J. Virol. 2004; 78(24): 13409–13419. DOI: 10.1128/JVI.78.24.13409-13419.2004.
12. Moore P. L., Crooks E. T., Porter L. et al. Nature of nonfunctional envelope proteins on the surface of human immunodeficiency virus type 1 // J. Virol. 2006; 80(5): 2515–2528. DOI: 10.1128/JVI.80.5.2515-2528.2006.
13. Parren P. W., Burton D. R., Sattentau Q. J. HIV-1 antibody — debris or virion? // Nat. Med. 1997; 3(4): 366–367. DOI: 10.1038/nm0497-366d.
14. Quan F. S., Sailaja G., Skountzou I. et al. Immunogenicity of virus-like particles containing modified human immunodeficiency virus envelope proteins // Vaccine. 2007; 25(19): 3841–3850. DOI: 10.1016/j.vaccine.2007.01.107.
15. Lanteri M., Giordanengo V., Hiraoka N. et al. Altered T cell surface glycosylation in HIV-1 infection results in increased susceptibility to galectin-1-induced cell death // Glycobiology. 2003; 13(12): 909–918. DOI: 10.1093/glycob/cwg110.
16. Munro J. B., Gorman J., Ma X. et al. Conformational dynamics of single HIV-1 envelope trimers on the surface of native virions // Science. 2014; 346(6210): 759–763. DOI: 10.1126/science.1254426.
17. Chahroudi A., Silvestri G. What pediatric nonprogressors and natural SIV hosts teach us about HIV // Sci. Transl. Med. 2016; 8(358): 358fs316. DOI: 10.1126/scitranslmed.aaj1874.
18. Stacey A. R., Norris P. J., Qin L. et al. Induction of a striking systemic cytokine cascade prior to peak viremia in acute human immunodeficiency virus type 1 infection, in contrast to more modest and delayed resp — onses in acute hepatitis B and C virus infections // J. Virol. 2009; 83(8): 3719–3733. DOI: 10.1128/JVI.01844-08.
19. Grossman Z., Meier-Schellersheim M., Paul W. E., Picker L. J. Pathogenesis of HIV infection: what the virus spares is as important as what it destroys // Nat. Med. 2006; 12(3): 289–295. DOI: 10.1038/nm1380.


* Prime-boost — метод иммунизации в несколько этапов и с использованием разных типов препаратов, причем первые дозы активирует иммунный ответ, а последующие — усиливают и закрепляют эффект.

Источник: elementy.ru

Андрей Взоров
«Природа» №10, 2018

Нелишним будет напомнить, что вирус иммунодефицита человека (ВИЧ, или HIV, от англ. human immunodeficiency virus) относится к роду лентивирусов (Lentivirus) семейства ретровирусов (Retroviridae). Несмотря на кодирование только 15 зрелых белков, ВИЧ-1 (самый распространенный тип ВИЧ) может вызывать персистентную форму инфекции у людей, при этом избегать врожденных и адаптивных иммунных ответов. Наиболее важная характеристика иммунобиологии ВИЧ и SIV (от англ. simian immunodeficiency virus — ‘вирус иммунодефицита обезьян’) — скорость и динамичность этих вирусов. Несмотря на то что их групповое название рода происходит от латинского слова lente (‘медленный’) и дано на основе медленного клинического проявления инфекции, лентивирусы способны быстро создать большую генетически гибкую адаптивную вирусную популяцию до появления эффективного противовирусного иммунитета и, как следствие, могут быстро образовывать вирусные варианты в ответ на селективное давление окружающей среды. Эта стратегия почти всегда дает вирусу возможность быть на шаг впереди эффективного иммунного ответа.

Сферической формы частица ВИЧ диаметром 100–180 нм окружена клеточной двуслойной мембраной, под которой находится матриксный белок и конической формы белковый капсид, содержащий две молекулы РНК и ферменты, обеспечивающие размножение вируса в клетке.

Внутри вириона и на поверхности его мембраны находятся белки, часть которых кодируется девятью вирусными генами, а часть, как и сама мембрана, захватывается из хозяйской клетки. Мембранные белки ВИЧ нужны, чтобы вирусная частица могла взаимодействовать с рецепторами клеток-мишеней, после чего мембраны вириона и клетки сливаются, а его содержимое попадает внутрь ее цитоплазмы. ВИЧ интегрирует свои гены в клеточный геном и вызывает латентную форму инфекции.

ВИЧ поражает в основном клетки иммунной системы, которые несут рецепторы CD4 (CD+-клетки). В ранних исследованиях, в которых молекулу CD4 идентифицировали в качестве рецептора ВИЧ и SIV, развитие синдрома приобретенного иммунного дефицита (СПИД) объяснялось потерей CD4+ Т-клеток. Сокращение этой субпопуляции иммунных клеток может привести к недостаточным антивирусным иммунным ответам, которые будут способствовать устойчивой вирусной репликации и утрате иммунного контроля. Однако на самом деле первоначальные адаптивные иммунные ответы (в частности CD8+ Т-клеток) на ВИЧ-инфекцию достаточно сильны. Это свидетельствует о том, что плохой адаптивный иммунный контроль над ВИЧ-инфекцией не может быть следствием потери CD4+ T-клеток. Более того, ВИЧ целенаправленно воздействует на врожденный иммунитет, включая свои вирусные гены vpu и vif, которые противодействуют клеточным антивирусным белкам — тетерину и APOBEC3G (от англ. apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptidelike 3G) соответственно.

На фоне прогрессирующей ВИЧ-инфекции и развивающегося СПИДа организм больного теряет возможность защищаться, возникают вторичные оппортунистические заболевания, которые без адекватного лечения приводят к смерти. По оценкам Всемирной организации здравоохранения, со времени открытия ВИЧ в мире заразилось более 70 млн человек, из которых более половины — умерли. В конце 2017 г. было зарегистрировано почти 37 млн инфицированных ВИЧ, из них более 1,2 млн — россияне.

Единственный доступный сейчас вид лечения ВИЧ-инфекции / СПИДа — высокоактивная антиретровирусная терапия, которая должна проводиться пожизненно, поскольку не избавляет больного от вируса. Решить эту проблему может лишь разработка эффективных вакцин и методов профилактики ВИЧ. В отличие от традиционных противовирусных вакцин, которые препятствуют развитию болезни, но позволяют инфекции начаться, вакцина против ВИЧ должна полностью ее предотвращать. Иными словами, для профилактики ВИЧ-инфекции необходимо наличие нейтрализующих антител, которые блокируют проникновение вируса в клетки.

Самая важная и критическая мишень для адаптивных иммунных реакций — шипы на вирусной частице, образованные гликопротеином Env (от англ. envelope protein), который состоит из двух субъединиц: вариабельного белка gp120, обладающего функцией связывания с рецептором, и более консервативного трансмембранного gp41, удерживающего в мембране молекулу gp120 и опосредующего слияние с клеточной мембраной (рис. 1). Функциональные сайты шипов защищены от иммунной системы хитроумными вирусными механизмами, обойти которые пока не удается, поэтому эффективной вакцины, создающей протективный иммунитет против ВИЧ-инфекции, до сих пор не существует. Поверхностный гликопротеин Env вирус использует для проникновения в определенные клетки (тропизм), взаимодействуя с их специфическими рецепторами (CD4, CCR5, CXCR4). Возможность изменения тропизма ВИЧ во время инфекции обеспечивается биологическими свойствами Env — большой гибкостью и изменчивостью этого белка.

Биологические свойства Env

На начальных стадиях инфекции гликопротеин Env всех ретровирусов, связываясь с поверхностными клеточными рецепторами, способствует проникновению вириона в клетку путем мембранного слияния, на поздних — участвует в вирусной сборке [1]. Кроме того, есть доказательства внутриклеточного взаимодействия Env с матриксным белком, с клеточными белками, ассоциированными с мембранным микродоменом (липидным рафтом), а также прямого влияния гликопротеина на участок сборки и почкования вирусных частиц в поляризованных эпителиальных клетках [1, 2].

У лентивирусов, в отличие от других ретровирусов, Env содержат необычно длинный домен — цитоплазматический хвост (CT, от англ. cytoplasmic tail) из приблизительно 150–200 аминокислотных остатков (а.о.). Хвост трансмембранного белка может стать короче из-за досрочной остановки его синтеза, что используется ВИЧ или SIV как потенциальный механизм адаптации к новым типам клеток или ускользания от ингибиторов, блокирующих проникновение вирусов в клетки. Вирусные частицы с коротким СТ дефектны на ранних этапах репликации, после проникновения вируса в клетки [1]. Для поддержки их инфекционности нужна более высокая множественность при заражении, чем для вируса с полноразмерным СТ (для заражения клетки достаточно одной вирусной частицы с полноразмерным СТ). К полезным свойствам короткого белка Env для вирусной популяции относится способность заражать больше видов клеток-мишений. Это связано с повышенной способностью короткого белка Env к мембранному слиянию. Полноразмерный цитоплазматический хвост содержит множественные мотивы, включая три высококонсервативные α-спиральные лентивирусные литические пептидные домены (LLP, от англ. lentivirus lytic peptide) — LLP-1, LLP-2 и LLP-3 (см. рис. 1), которые взаимодействуют с клеточной мембраной, снижают ее стабильность и проницаемость для ионов, а также влияют на патогенность (цитопатичность) вируса. Весь этот уникальный набор молекулярных механизмов Env-тримеров, из которых состоят шипы ВИЧ, нужен вирусной частице, повторю, для возможности проникать в клетки и заражать их разные популяции. На функциональной пластичности Env основано большое разнообразие иммуновариантов ВИЧ.

Как известно, ВИЧ обычно передается половым путем через слизистые (мукозные) оболочки, оснащенные мощными средствами защиты — различными лимфоидными клетками. В начале инфекции Env имеет компактную форму с короткими вариабельными петлями, при этом он остается белком высокопатогенного (трансмиссивного) штамма вируса-основателя. Именно эти свойства Env-тримера помогают вирусу эффективно преодолевать мукозный барьер. Таким образом ВИЧ удается ускользать от клеток иммунной системы и быть устойчивым (резистентным) к γ-интерферону, который обязан сдерживать распространение вируса. Дендритные клетки, которые должны предъявлять иммунной системе чужеродные антигены, хоть и эффективно захватывают вирусные частицы, но тем самым лишь ускоряют их перенос к клеткам-мишеням, поскольку ВИЧ при этом умудряется сохранить неизменное (интактное) состояние.

В процессе инфекции ген env, кодирующий gp120 и gp41, меняется так, чтобы вирус получил возможность взаимодействовать с рецепторами и корецепторами определенных клеток-мишеней. ВИЧ размножается (реплицируется) в активированных CD4+ Т-клетках, а чтобы проникнуть в них, использует высокий уровень поверхностного рецептора CD4 и корецептора CCR5. На поздних стадиях инфекции у примерно 50% людей, заразившихся ВИЧ-1, шипы Env переключаются на CXCR4-корецепторы, позволяя вирусам проникать в другие популяции иммунных клеток (В- и Т-лимфоциты, дендритные клетки, моноциты). Так, CD4-независимый ВИЧ начинает реплицироваться в популяциях клеток с низким содержанием CD4+ (макрофагах) или даже вовсе без них — в клетках микроглии в головном мозге, что вызывает неврологические расстройства у примерно 10% ВИЧ-инфицированных.

Включение Env в оболочку частиц при их сборке происходит в несколько этапов. Сначала субъединица gp41 взаимодействует с мембранным белком Rab11-FIP1C (от англ. Rab11 family interacting protein С1), а затем с матриксным белком Gag (от англ. group antigen), который формирует так называемую решетку длинного диапазона (англ. longrange lattice), захватывающую белки Env, что предотвращает их эндоцитоз и создает условия для размещения длинного домена gp41, а значит гарантирует включение Env в вирион [3]. Однако в случае мутаций гена, кодирующего этот домен, таких гарантий не будет, и тут преимущества короткого CT становятся очевидны: он способен преодолеть отсутствие специфического взаимодействия Env с матриксным белком (возможно, спасение Env связано со снятием стерического столкновения между Gag и CT). В результате эксперимента было установлено, что частицы ВИЧ-1 способны включать в оболочку белки Env различных вирусов, чьи гликопротеины имеют короткие цитоплазматические хвосты [4]. Для изучения процесса сборки частиц SIV, на каждой из которых от 15 до 130 шипов, и сравнения включения полноразмерного и усеченного белков Env была использована рекомбинантная экспрессионная система вируса осповакцины. Оказалось, что белки Env с коротким CT-доменом длиной 3 или 17 а.о. (СТ-3 или СТ-17) встраиваются в мембрану и высвобождаются из клеток в составе вирусоподобных частиц (VLP, от англ. virus-like particle) в 10 раз эффективнее, чем полноразмерный Env длиной 165 а.о. (рис. 2). Кроме того, белки Env с укороченным CT способны группироваться на поверхности клеток, причем собираются в плотно упакованную структуру (плотнее, чем образуемая полноразмерным Env), что, видимо, способствует интенсивному включению белков Env с короткими CT в состав VLP [5]. С помощью электронного микроскопа на вирусоподобных частицах идентифицирован слой шипов, который заметно выше на частицах с усеченным CT (рис. 2, а), чем на частицах с полноразмерным Env (рис. 2, б). Аналогичные результаты получены для SIV с укороченными / полноразмерными белками Env.

На протяжении многих лет считалось, что белки поверхностных шипов, необходимые для развития инфекции, включаются в вирионы посредством прямого взаимодействия между их CT-доменами и так называемыми кор-компонентами (матричными и капсидными белками) вируса. Однако позднее выяснилось, что это условие не распространяется на ретровирусы: РНК-вирусы могут накапливаться и в отсутствие белков шипов, достаточно наличия лишь вирусных кор-компонентов [6]. Это оказалось полезным для получения VLP (неинфекционных ретровирусоподобных частиц, имитирующих морфологию естественно циркулирующих вирионов), в состав которых обычно входит только полипротеин Gag, но можно включать и разные Env [6]. Важно, что использование VLP в качестве антигена усиливает первичный иммунный ответ.

Получен еще один интересный результат: размер СТ-домена гликопротеина Env вируса SIV может влиять на трехмерную структуру (конформацию) внешнего домена трансмембранной субъединицы [7]. При использовании непроницаемого для мембран реагента биотинилирования белков Env SIVmac239, с полноразмерным или усеченным CT на клеточных поверхностях с последующей иммунопреципитацией, в условиях, при которых на поверхности CD4+— или CD4— клеток выявляли только усеченные варианты белка, полноразмерный gp41 обнаружить не удавалось. В то же время с помощью мембранно-непроницаемого реагента с радиоактивным йодом для мечения белков на поверхности клеток обнаруживали как gp41 полной длины, так и его усеченные варианты. Разницы в обнаружении поверхностных субъединиц, gp120, полноразмерных или усеченных белков не наблюдалось [8]. Эти результаты показали, что укорочение цитоплазматического домена гликопротеина оболочки SIV изменяет конформацию внешнего домена белка gp41. От длины СТ-домена зависят очень важные биологические характеристики SIV — активность репликации и чувствительность к нейтрализующим антителам [9]. Именно различная конформация белка Env, обусловленная длиной СТ, по-видимому, определяет различия в фенотипах вирионов SIV (например, чувствительный к нейтрализации фенотип имеет короткий СТ, а резистентный к нейтрализации — полноразмерный).

В процессе эволюции у оболочечных вирусов для мембранного слияния сформировался механизм, использующий энергию от необратимой модификации (рефолдинга) гликопротеинов Env: белки сначала образуют метастабильную форму, которая затем подвергается каскаду жестко регулируемых конформационных изменений, высвобождая белки, индуцирующие слияние в более низкое энергетическое состояние. Этот механизм для вирусного слияния — одноразовый, он не требует АТФ в качестве источника энергии. Специальные исследования (конформационная фиксация лигандами, такими как молекулы CD4 или имитирующие CD4 антитела, и термодинамический анализ взаимодействий в gp120) показали тенденцию этой внешней субъединицы ВИЧ-1 к принятию CD4-связанной конформации, которая сдерживается V1–V2- и V3-вариабельными петлями gp120. Другими словами, на поверхности вирусной частицы Env-тример находится в метастабильном состоянии, т.е. квазиустойчивом равновесии, в котором система может находиться длительное время благодаря сдерживающим факторам (V1, V2 и V3). Это напоминает сжатую пружину. Показано, что из такого метастабильного состояния Env-тример легко выходит и образует стабильную форму при связывании с CD4-рецептором. Именно при стабилизации Env-тримера открываются консервативные сайты (закрытые у метастабильной формы), или эпитопы для нейтрализующих антител. Однако многочисленные попытки получения открытых форм Env-тримеров путем удаления V1–V2-петель ни к чему не привели. Были получены Env-тримеры с искусственной конформацией, индуцирующей неспецифический иммунный ответ. Прорывными оказались исследования, в которых было показано, что изменения в аминокислотной последовательности трансмембранной субъединицы Env опосредованно влияли на функциональные свойства gp120 [6–9]. Если представить Env-белок в форме зонтика, то изменения в его ручке (gp41) отражаются на форме его купола (gp120). Амфипатическая последовательность LLP-2 в цитоплазматическом хвосте gp41 изменяла клеточный тропизм ВИЧ-1, модулируя специфичность вирусного рецептора, который распознается поверхностной субъединицей gp120 (см. рис. 1) [10]. Таким образом, эти исследования показали, что специфическая последовательность в СТ-домене опосредованно влияет на функциональные области в поверхностной субъединице ВИЧ-1.

Более того, другое исследование доказывало, что СТ-домены могут индуцировать конформационные изменения в функциональных областях gp120 и модулировать тропизм рецептора, но не изменяют специфичность корецептора ВИЧ-1 [11]. Изменения в СТ-домене могут существенно влиять на функцию рецепторсвязывающих сегментов в gp120 и раскрывать сайты, связывающие корецептор в модифицированных белках Env. Так, было впервые продемонстрировано, что с помощью модификации в СТ-домене можно получить «открытые» формы Env-тримера с CD4-связанной конформацией.

Механизмы ускользания Env от иммунных ответов

Как только Env-тримеры достигают мембраны клетки (в которой они синтезируются), Env подвергается эндоцитозу через свои мотивы Y712SPL и L855L856 в цитоплазматическом домене, которые взаимодействуют с комплексом клеточных адаптерных белков AP-1 и AP-2. Поверхностная экспрессия белка Env, а также его стабильность на поверхности клеток повышались при мутации Tyr (Y710S) остатка YXXA мотива в СТ-домене. При анализе CD8 Т-клеточных иммунных ответов у иммунизированных мышей эффекта на мутацию Tyr остатка не наблюдалась. Однако мутантные Env индуцировали более значительные уровни ответов специфических антител. Регуляция поверхностной клеточной экспрессии (уровень на клеточной поверхности уменьшается, при этом экспрессия гена, кодирующего Env белок, не изменяется) белка Env сигналами эндоцитоза в СТ-домене может служить стратегией ускользания ВИЧ от иммунной системы [11].

На поверхности вириона ВИЧ-1 выставляется всего около 7–14 шипов (Env). Столь небольшое их количество необычно для оболочечных вирусов: например, у вируса гриппа их до 400–500 шипов, у вируса везикулярного стоматита — примерно 1200, у вируса саркомы Роуса — до 118 шипов, у вируса лейкемии мыши — около 100. Недостаток шипов на ВИЧ-1 может быть адаптацией и ускользанием от гуморального иммунитета путем ограничения мультивалентного взаимодействия с рецепторами В-клеток и, как следствие, снижения ответа В-клеток, а также предотвращения двухвалентного связывания с антителами, которое в противном случае могло усиливать нейтрализацию антителами (рис. 3). Надо пояснить, что антитела класса IgG имеют два идентичных антигенсвязывающих сайта. В случае распознавания повторяющихся эпитопов, обнаруженных на поверхностях вирусных частиц (множественное включение шипов в оболочку ВИЧ), бивалентность IgG способствует повышению энергии связывания (аффинности).

Клеточные белки или Env с различными СТ-доменами могут быть включены в частицы ВИЧ, что полезно вирусу для защиты от иммунного ответа: у него появляется возможность прикрепляться к различным клеткам-мишеням посредством разнообразных белков Env и за счет приобретенных клеточных белков. Несмотря на частичное нарушение взаимодействия между белками Env и Gag, короткие формы белка Env влияют на сборку вирусных частиц. Укороченный СТ-домен белка Env вируса SIV влияет на включение клеточных и чужеродных вирусных белков в вирусную оболочку. Обычно короткие белки Env встраиваются в частицы и за счет стерического взаимодействия вытесняют включение клеточных и гетерологичных белков, которые содержатся в вирионах с полноразмерным белком Env [11]. Именно состав поверхностных мембранных белков и их свойства определяют фенотипы вирусных частиц.

Во время инфекции ВИЧ-1 нефункциональные белки Env — нерасщепленные или дефектные тримеры, диссоциированные мономеры gp120, промежуточные формы gp41 и продукты деградации белка Env, которые преимущественно экспонируют иммунодоминантные эпитопы для не нейтрализующих антител (non-NAbs, от англ. non-neutralizing antibodies) на поверхности ВИЧ, — также вызывают образование антител (см. рис. 3) [12, 13]. Это еще один механизм ускользания ВИЧ, и нефункциональные формы Env служат для отвлечения внимания B-клеток от тримеров. Ответ антител по отношению к каждому из чужеродных антигенов на поверхности частиц зависит от их относительной доступности для связывания с антителами. Таким образом, высокая доступность нефункциональных форм Env может объяснить их очевидное иммунное доминирование. Антитела, которые реагируют на мономеры (gp120/gp41 или gp41), не вступают в реакцию с тримером, вероятно, потому, что их эпитопы находятся на другой легко доступной поверхности шипа Env.

Кроме того, на поздних стадиях инфекции, чаще всего, Env-шип имеет «ослабленную» конформацию: на фоне развития иммунодефицита у него снижается резистентность, он выставляет на поверхности дополнительные эпитопы для нецелевых иммунных ответов, которые также блокируют образование нейтрализующих антител [8, 9, 11].

Оболочечный белок Env ВИЧ — наиболее N-гликозилированный белок из всех известных поверхностных вирусных гликопротеинов. Один из главных механизмов ускользания ВИЧ от иммунного ответа — интенсивное и многоступенчатое гликозилирование тримера Env (см. рис. 3) [14]. Его предшественник — gp160 — синтезируется в эндоплазматическом ретикулуме, где он гликозилируется и олигомеризуется в тримеры. Олигомеризация обеспечивает доставку gp160-тримеров в аппарат Гольджи, где в ходе процессинга гликанов боковые цепи олигосахаридов с высоким содержанием маннозы приобретают различные комплексные модификации. Однако олигомеризация Env в тримеры создает труднодоступные места, в которых последующий процессинг высокоманозных гликанов затруднен. В связи с тем, что именно в труднодоступных областях Env находятся чувствительные к нейтрализации эпитопы, высокоманозные гликаны еще больше осложняют их распознавание антителами. Получены доказательства, что гликозилирование маскирует антигенные участки на Env-шипе. Расщепление Env-тримеров клеточной протеазой фурином в аппарате Гольджи образует структуру гликопротеинов gp120—gp41. Некоторые нейтрализующие антитела широкого спектра могут распознавать N-связанные гликаны в высокоманозных участках Env-белка. Однако в связи с тем, что гликозилирование белка Env зависит от типа продуцирующих клеток и может изменяться в течение хронической ВИЧ-инфекции, такие антитела не обладают широкой нейтрализующей активностью [15]. Это также осложняет разработку вакцин, в которых в качестве антигена используется нативный Env-белок. Такие вакцинные препараты будут индуцировать гликанзависимые антитела, неэффективные для профилактики ВИЧ-инфекции.

Белок Env способен изменять свою собственную антигенность как в процессе слияния с клеточной мембраной, так и во время инфекции (см. рис. 3). Стратегией ускользания ВИЧ от иммунной системы является не только труднодоступность консервативных эпитопов, но и Env-шип, который сам по себе служит движущейся мишенью для антител (рис. 4). Для наблюдений за конформационными переходами нативных Env-шипов на поверхности вирионов ВИЧ-1 в режиме реального времени был использован одномолекулярный перенос энергии резонанса флуоресценции [16]. Изоляты ВИЧ представляют Env-шипы на поверхности вирионов в конформационной динамике от закрытых до ослабленных конформаций. В зависимости от вида изолята преобладает та или иная конформация. Например, для первичных изолятов характерна закрытая конформация. Белки с закрытой конформацией вызывают образование нейтрализующих антител широкого спектра действия. Для лабораторно-адаптированных изолятов ВИЧ характерна динамика из трех конформаций: закрытой, промежуточной и ослабленной (см. рис. 4).

Взаимодействие с иммунной системой и резистентность ВИЧ

ВИЧ-инфекция вызывает мощные клеточные и гуморальные иммунные ответы. Однако поразительная особенность заключается в том, что иммунная система человека не способна установить эффективный иммунный контроль. Сильные клеточные и гуморальные иммунные ответы не устраняют ВИЧ-инфекцию, более того, даже не способны эффективно контролировать вирусную репликацию. Лентивирусы, вызывающие СПИД у людей и азиатских «нечеловекообразных» приматов (NHP, от англ. nonhuman primates — все приматы, кроме человека), происходят из эндемичных SIV, которые у своих хозяев — африканских NHP — обычно не вызывают заболевания. Отсутствие патогенности не обусловлено способностью этих естественных хозяев иммунологически контролировать репликацию SIV, а скорее всего обусловлено их способностью к адаптации, которая предотвращает неблагоприятное воздействие высокой вирусной репликации на иммунную систему [17]. Это контрастирует с подавляющим большинством вирусных патогенов, для которых иммунный контроль репликации играет главнейшую роль в предотвращении патогенных последствий (в том числе даже персистентных вирусов, таких как вирусы семейства герпесвирусов).

Нельзя сказать, что иммунная система поздно реагирует на ранние события ВИЧ-инфекции. Более того, наблюдается ранний интенсивный цитокиновый шторм. Однако при острой инфекции ВИЧ-1 он имеет иммунопатологические последствия, стимулирует иммунную активацию, репликацию вируса и утрату CD4+ Т-клеток [18]. Это происходит после двух недель инфекции при распространении ВИЧ в лимфатических тканях. Интересно, что в течение той же фазы при инфекции, вызванной вирусом гепатита В, наблюдается сравнительно небольшое отклонение в уровнях цитокинов в плазме, а при остром гепатите C — отсроченный ответ средней величины. Это указывает на то, что быстрая активация системного цитокинового каскада не может считаться необходимым условием для удаления вируса. В начале инфекции противовирусные ответы антител также очень сильны (рис. 5), тем не менее дальнейшие события показывают их неэффективность в защите от развития заболевания. Аутогенные нейтрализующие антитела вырабатываются в ответ на Env-тример трансмиссивного штамма основателя ВИЧ. Эти антитела ингибируют трансмиссионный вирус, но в тоже время вызывают появление ускользающих мутаций в Env-тримере и образование нового иммунного варианта ВИЧ (см. рис. 5). В результате формируются нейтрализующие антитела, которые ингибируют этот вариант ВИЧ, но стимулирует ускользающие мутации в Env-тримере. Эта ситуация повторяется многократно. В конце концов нейтрализующие антитела широкого спектра действия возникают как результат экстенсивных соматических гипермутаций иммунных клеток. Через два-три года после начала инфекции нейтрализующие антитела широкого спектра действия (bNAbs) вырабатываются у 10–30% пациентов с хронической формой ВИЧ-инфекции, но они неэффективны у этих пациентов. У большинства инфицированных антивирусные CD8+ Т-клеточные ответы также неэффективны. Это происходит даже в том случае, если ответы нацелены на вирусные варианты без видимых дефектов и не связаны с мутациями в последовательностях. Таким образом, CD8+ Т-клеточные ответы не могут достичь высокого уровня эффекторной реакции к эпитопам-мишеням для воздействия на репликацию вируса.

Механизмы дифференцировки Т-клеток памяти имеют основополагающее значение для иммунопатогенеза ВИЧ [19]. Поскольку ВИЧ является CCR5-тропным, дифференцировка Т-клеток памяти обеспечивает ВИЧ мишеням эффекторные CD4+ клетки памяти, которые только на поздних стадиях дифференцировки синтезируют высокий уровень CCR5, чувствительны для ВИЧ, при этом популяция их предшественников, центральные Т-клетки памяти благодаря низкому содержанию CCR5 защищены от ВИЧ-инфекции. Где у ВИЧ «ахиллесова пята»? Все больше доказательств того, что ранняя стадия передачи ВИЧ уязвима для иммунного вмешательства. «CCR5-тропизм» фокусирует ВИЧ/SIV инфекцию на дифференцированных CD4+ эффекторных Т-клетках памяти. Напомню, эффекторные CD4+ Т-клетки памяти — это пополняемый резервуар потенциальных клеток-мишеней для ВИЧ. Пациенты, которым были пересажены трансплантаты костного мозга от доноров, не имеющих одной или обеих копий полноразмерного CCR5, демонстрировали длительные ремиссии без обнаружения признаков инфекции ВИЧ-1. «Окно возможностей» — это самый ранний период от начала заражения, когда иммунные ответы, вызванные вакциной, которая нацелена на индукцию Т-клеточных ответов, способны перехватывать развивающуюся инфекцию. Т-клеточная вакцина, которая вводится в режиме prime-boost*, сокращает время получения пика эффекторных ответов, но эти ответы развиваются после «окна возможностей» и не предотвращают необратимую системную инфекцию. Напротив, персистентные цитомегаловирусные векторы, непрерывно продуцирующие высокочастотные эффекторные ответы в пределах «окна возможностей», способны подавлять инфекцию. Однако вакцины Т-клеточной направленности не могут полностью предотвращать развитие ВИЧ-инфекции в связи с тем, что не способны блокировать проникновение вируса в клетку. Инфекция развивается после окончания действия таких векторов.

Многочисленные механизмы ускользания ВИЧ от иммунной системы, связанные с Env-тримерами, и отсутствие прецедента естественного иммунитета, ведущего к удалению ВИЧ и устойчивой иммунной защите от суперинфекции, указывают на то, что разработка эффективной вакцины против ВИЧ/СПИДа потребует разработки новых иммуногенов, вызывающих защитный иммунный ответ против ВИЧ, который не смогла создать природа. Новым подходам к созданию такой вакцины будет посвящена следующая статья — в ноябрьском номере «Природы».

Литература
1. Vzorov A. N., Weidmann A., Kozyr N. L. et al. Role of the long cytoplasmic domain of the SIV Env glycoprotein in early and late stages of infection // Retrovirology. 2007; 4: 94. DOI: 10.1186/1742-4690-4-94.
2. Owens R. J., Compans R. W. Expression of the human immunodeficiency virus envelope glycoprotein is restricted to basolateral surfaces of polarized epithelial cells // J. Virol. 1989; 63(2): 978–982.
3. Tedbury P. R., Novikova M., Ablan S. D., Freed E. O. Biochemical evidence of a role for matrix trimerization in HIV-1 envelope glycoprotein incorporation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2016; 113(2): E182–E190. DOI: 10.1073/pnas.1516618113.
4. Chertova E., Bess J. W., Jr. et al. Envelope glycoprotein incorporation, not shedding of surface envelope glycoprotein (gp120/SU), Is the primary determinant of SU content of purified human immunodeficiency virus type 1 and simian immunodeficiency virus // J. Virol. 2002; 76(11): 5315–5325. DOI: 10.1128/JVI.76.11.5315-5325.2002.
5. Vzorov A. N., Compans R. W. Assembly and release of SIV env proteins with full-length or truncated cytoplasmic domains // Virology. 1996; 221(1): 22–33. DOI: 10.1006/viro.1996.0349.
6. Взоров А. Н., Тенцов Ю. Ю., Григорьев В. Б. и др. Образование вирусоподобных частиц белков Gag ВИЧ-1, экспрессируемых рекомбинантным вирусом осповакцины // Молекулярная биология. 1990; 24(6): 1666–1674.
7. Spies C. P., Ritter G. D., Jr. et al. Truncation of the cytoplasmic domain of the simian immunodeficiency virus envelope glycoprotein alters the conformation of the external domain // J. Virol. 1994; 68(2): 585–591.
8. Vzorov A. N., Compans R. W. Effect of the cytoplasmic domain of the simian immunodeficiency virus envelope protein on incorporation of heterologous envelope proteins and sensitivity to neutralization // J. Virol. 2000; 74(18): 8219–8225. DOI: 10.1128/JVI.74.18.8219-8225.2000.
9. Vzorov A. N., Gernert K. M., Compans R. W. Multiple domains of the SIV Env protein determine virus replication efficiency and neutralization sensitivity // Virology. 2005; 332(1): 89–101. DOI: 10.1016/j.virol.2004.10.044.
10. Vzorov A. N., Yang C., Compans R. W. An amphipathic sequence in the cytoplasmic tail of HIV-1 Env alters cell tropism and modulates viral receptor specificity // Acta Virol. 2015; 59(3): 209–220. DOI: 10.4149/av-2015-03-209.
11. Ye L., Bu Z., Vzorov A. et al. Surface stability and immunogenicity of the human immunodeficiency virus envelope glycoprotein: role of the cytoplasmic domain // J. Virol. 2004; 78(24): 13409–13419. DOI: 10.1128/JVI.78.24.13409-13419.2004.
12. Moore P. L., Crooks E. T., Porter L. et al. Nature of nonfunctional envelope proteins on the surface of human immunodeficiency virus type 1 // J. Virol. 2006; 80(5): 2515–2528. DOI: 10.1128/JVI.80.5.2515-2528.2006.
13. Parren P. W., Burton D. R., Sattentau Q. J. HIV-1 antibody — debris or virion? // Nat. Med. 1997; 3(4): 366–367. DOI: 10.1038/nm0497-366d.
14. Quan F. S., Sailaja G., Skountzou I. et al. Immunogenicity of virus-like particles containing modified human immunodeficiency virus envelope proteins // Vaccine. 2007; 25(19): 3841–3850. DOI: 10.1016/j.vaccine.2007.01.107.
15. Lanteri M., Giordanengo V., Hiraoka N. et al. Altered T cell surface glycosylation in HIV-1 infection results in increased susceptibility to galectin-1-induced cell death // Glycobiology. 2003; 13(12): 909–918. DOI: 10.1093/glycob/cwg110.
16. Munro J. B., Gorman J., Ma X. et al. Conformational dynamics of single HIV-1 envelope trimers on the surface of native virions // Science. 2014; 346(6210): 759–763. DOI: 10.1126/science.1254426.
17. Chahroudi A., Silvestri G. What pediatric nonprogressors and natural SIV hosts teach us about HIV // Sci. Transl. Med. 2016; 8(358): 358fs316. DOI: 10.1126/scitranslmed.aaj1874.
18. Stacey A. R., Norris P. J., Qin L. et al. Induction of a striking systemic cytokine cascade prior to peak viremia in acute human immunodeficiency virus type 1 infection, in contrast to more modest and delayed resp — onses in acute hepatitis B and C virus infections // J. Virol. 2009; 83(8): 3719–3733. DOI: 10.1128/JVI.01844-08.
19. Grossman Z., Meier-Schellersheim M., Paul W. E., Picker L. J. Pathogenesis of HIV infection: what the virus spares is as important as what it destroys // Nat. Med. 2006; 12(3): 289–295. DOI: 10.1038/nm1380.


* Prime-boost — метод иммунизации в несколько этапов и с использованием разных типов препаратов, причем первые дозы активирует иммунный ответ, а последующие — усиливают и закрепляют эффект.

Источник: elementy.ru


You May Also Like

About the Author: admind

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Этот сайт использует Akismet для борьбы со спамом. Узнайте как обрабатываются ваши данные комментариев.