Метод иммуноблота



Назначение: набор recomLine Toxoplasma IgM [IgA] предназначен для качественного определения человеческих IgM/IgA-антител к Toxoplasma gondii в образцах сыворотки или плазмы методом иммуноблота с целью подтверждения результатов скрининговых тестов.

Замечание: оценку и интерпретацию результатов определения IgG-, IgM и IgA-антител методом иммуноблота рекомендуется проводить в совокупности.

Анализируемые антигены: рекомбинантные высокоочищенные белки Toxoplasma gondii ROP1c, MIC3, GRA7, GRA8, p30, MAG1, GRA1, rSAG1.

Чувствительность: для IgM 83.2%, для IgA 100%.

Специфичность: для IgM 93.2%, для IgA 96%.

Приложения теста: токсоплазмоз – паразитарное заболевание, возбудителем которого является внутриклеточный паразит Toxoplasma gondii. Представители семейства кошачьих являются окончательными хозяевами этого патогена. Половой цикл развития происходит только в организме окончательного хозяина, приводя к выделению инфекционных ооцист возбудителя.

и альтернативном пути жизненного цикла паразита человек может заразиться при употреблении недостаточно термически обработанного мяса, так как Toxoplasma gondii персистирует у свиней, коз и других млекопитающих. Еще одним источником инфекции может быть трансплацентарная передача Toxoplasma gondii от недавно инфицированной матери к плоду (врожденный токсоплазмоз). Токсоплазмоз – одно из наиболее частых паразитарных заболеваний в центральной Европе. Частота сероположительных случаев в популяции высока и повышается с возрастом. Она увеличивается примерно на 1% за год жизни. Встречаемость врожденного токсоплазмоза в центральной Европе примерно 5-6 случаев на 1000 живых новорожденных. Течение инфекции Toxoplasma gondii у иммунокомпетентных людей обычно бессимптомное, редко развиваются неспецифические симптомы, похожие на грипп. Начальная инфекция переходит в пожизненную персистенцию паразита или приводит к пожизненному иммунитету к инфекции Toxoplasma gondii. После инфицирования патоген вначале проходит фазу обязательной внутриклеточной пролиферации в форме быстро делящихся тахизоитов. Затем начинается дифференцировка тахизоитов в брадизоиты под влиянием иммунного ответа. Брадизоиты персистируют на протяжении жизни хозяина в нервных тканях и мускулатуре, образуя кисты. Врожденный токсоплазмоз может вызывать серьезные повреждения плода. Вероятность заражения повышается, хотя тяжесть клинических проявлений при этом снижается, при увеличении срока беременности. Инфицирование в первом триместре обычно приводит к гибели плода.

угие исходы включают энцефалит с тяжелыми неврологическими расстройствами, дети с субклинически протекающей инфекцией, у которых могут проявляться незначительные отставания в умственном развитии или вообще отсутствовать любые симптомы. Лекарственная терапия может быть назначена при подтверждении первичной инфекции в период беременности. Как правило, такие меры существенно снижают тяжесть симптомов и, в дальнейшем, осложнений, вызванных внутриутробной инфекцией Toxoplasma gondii. Токсоплазмоз также может приводить к серьезным осложнениям у иммунокомпрометированных больных. Диагностика: так как течение токсоплазменной инфекции обычно бессимптомное, диагностические процедуры основаны на серологических методах. Метод Sabin-Feldman, предложенный в 1948, до сих пор остается «золотым стандартом» в диагностике токсоплазмоза благодаря очень высокой чувствительности теста. Однако сам метод достаточно дорогой и сложный в постановке и в настоящий момент используется достаточно редко, в основном как референсный метод. Другими используемыми методами являются метод иммунофлуоресценции, реакция связывания комплемента и реакция агглютинации. Главной задачей всех этих серологических тестов являются, в основном, профилактические мероприятия в период беременности на основе факта, была ли беременная женщина вновь инфицирована или продуктивная инфекция присутствовала до зачатия. Гуморальный иммунный ответ начинается с образования IgM-антител через несколько дней после инфекции, пик может наблюдаться уже через 2-4 недели.

тр IgG начинает расти примерно через 2 недели после инфекции, достигая пика от 6-8 недель до 3 месяцев после инфицирования, и после этого начинает постепенно снижаться. Первые три месяца после инфекции называют I фазой инфекции (сероконверсия). В этот период рекомендуется проводить контроль титров каждые 2-3 недели. В последующей II фазе в норме наблюдаются высокие титры, но нет дополнительного увеличения титра антител. Эта фаза распространяется на период от примерно 3 до 6 месяцев после инфекции и называется фазой активной инфекции. Также рекомендуется проводить контроль титра каждые 2-3 недели на протяжении II фазы. Фазу I и фазу II объединяют как фазу острой инфекции. В следующей фазе заболевания (в фазе III) концентрация антител начинает снижаться, начиная с IgA и IgM, а затем и IgG. Специфические IgM-антитела в норме персистируют до одного года, но в некоторых случаях встречаются на протяжении 3 лет и дольше. Эта фаза (период с 6 по 12/36 месяцы после инфекции) называется фазой подострой инфекции. На этой фазе рекомендуется проводить контроль титра антител для подтверждения отсутствия роста титра. В последующей фазе латентной инфекции ни IgA, ни IgM антитела не выявляются, но присутствуют средние или низкие титры IgG. Существует иммунитет к последующему инфицированию Toxoplasma gondii. Фазы инфекции T. gondii обычно соответствуют следующим периодам времени: Фаза I: 0-3 месяцев после инфицирования, Фаза II: ~ 3-6 месяцев после инфицирования, Фаза III: -6-12 (-36) месяцев после инфицирования, Фаза IV: >12->(-36) месяцев после инфицирования.

огласно H.HIobil, K.Friese: ,,Pranantale Toxoplasmose. Infektionserkrankungen der Schwangeren und des Neugeborenen, 1998, 292-307]. Подводя итог, можно сказать, что выявления IgM-антител недостаточно для диагностики острого токсоплазмоза. В редких случаях острая инфекция сопровождается очень низким или практически неопределяемым уровнем IgM-антител («IgM-низкая реактивность»). В случае очень раннего начала терапии титры антител, в особенности титр IgM, быстро снижаются. Так как подтверждение присутствия IgM-антител в сыворотке является недостаточным критерием острой инфекции токсоплазмы; определение авидности сывороточных IgG-антител очень важно в диагностике токсоплазмоза. Рекомбинантные антигены, использованные в данном методе, получены из обеих форм T. gondii: тахозоитов, доминирующих в фазе продуктивной инфекции, и из брадизоитов, а также использованы общие для этих форм антигены. Это иммунодоминантные антигены, и реакция антител с ними облегчает подтверждение статуса инфекции. Характеристика используемых рекомбинантных антигенов: R0P1 (p66) — антиген тахизоитов и брадизоитов, для него характерен IgM-ответ, IgM-антитела персистируют, как правило, в подострой фазе инфекции, IgA-антитела редки, и обычно только в острой фазе, часто встречаются низкоавидные IgG-антитела в латентной фазе, нет титра IgG, если инфекция давно прошла.

G1 (p65) — антиген брадизоитов, обычно вызывает очень слабый IgA- и IgM-ответ, присутствуют IgG-антитела (с низкой авидностью), как правило, не в начале фазы I, нет низкоавидных IgG-антител в подострой и латентной фазе. rSAG1 (p30) — антиген тахизоитов, иногда неспецифически взаимодействует с IgM-антителами, IgG-антитела (с низкой авидностью), как правило, не появляются до фазы II, нет низкоавидных антител IgG в латентной фазе, титр IgG-антител обычно персистирует пожизненно. GRA7 (p29) — антиген тахизоитов и брадизоитов, IgM-антитела встречаются редко, но обычно исключительно в острой фазе, IgG-антитела (с низкой авидностью) уже присутствуют на ранней I фазе, повышена авидность IgG-антител до конца фазы I, титр IgG антител часто персистирует пожизненно GRA8 (P35) — антиген тахизоитов и брадизоитов, в острой фазе обычно присутствуют IgM-антитела, в подострой фазе их уровень снижается, IgG антитела (с низкой авидностью) уже присутствуют на ранней острой фазе, антитела с низкой авидностью часто встречаются также в подострой и латентной фазе, нет титра IgG, если инфекция давно прошла. Основным маркером IgM-ответа при тестировании методом recomLine Toxoplasma является антиген ROP1. IgM-антитела к другим антигенам имеют более низкую значимость. IgM-aнтитела к ROP1 практически всегда присутствуют на ранней фазе инфекции и обычно ответственны за долгосрочную персистенцию титра IgM. На ранней фазе инфекции также часто регистрируются IgM-антитела к GRA8, которые тоже достаточно часто персистируют в период острой фазы инфекции, хотя обычно не так долго.

M-ответ к GRA7 антигену встречается редко и обычно очень слабо выражен, и обычно встречается только в острой фазе инфекции. Данные для отдельных видов IgM (например, только ROP1- или GRA8-реактивность), без определения IgG-антител, должны оцениваться очень осторожно. Необходимо учитывать сероконверсию, но нельзя исключать неспецифическую реактивность. Таким образом, контроль титра через 2-3 недели является обязательным. При лечении титр IgM-антител заметно быстро падает. IgA-ответ в общем случае очень разнообразен. Его может не быть вообще, но присутствие IgA-антител может подтверждать острую токсоплазменную инфекцию. Тип IgA-ответа не дает существенной информации для острой фазы инфекции.

Источник: www.biochemmack.ru

В каких случаях назначается анализ

Вирус иммунодефицита человека – медленно прогрессирующая инфекция. Со времени проникновения в организм патогенов и до проявления первой симптоматики часто проходит достаточно продолжительное время, которое может достигать нескольких лет.

что такое иммуноблот на вич

На начальном этапе развития клинические проявления могут отсутствовать. Повышение общей температуры, недомогание, боль в горле, характерные ВИЧ-инфекции симптомы, человек путает с банальной простудой, а ведь инфекция продолжает прогрессировать. Поэтому специалисты ВИЧ-центров рекомендуют пройти комплексную диагностику в таких случаях:


  • если случился незащищенный половой акт с новым партнером;
  • если одноразовый медицинский шприц или иглу использовали повторно;
  • если недавно была нанесена татуировка или проведен пирсинг;
  • если обнаружена другая инфекция, путь передачи которой – половой (например, сифилис, бактериальный вагиноз, гонорея);
  • если произошел контакт с инфицированным человеком.

Иммуноблот на ВИЧ  проводится с использованием сыворотки или плазмы крови. Исследование на одном стрипе требует 1,5-2 мл крови или 15-25 мкл сыворотки.

Диагностическое мероприятие позволяет выявить антитела не только к вирусу иммунодефицита человека, но и к другим патогенам. В ходе исследования используют специальные наборы, характерные для различных заболеваний, например:

  • ВПГ1 и ВПГ2 IgM/IgG (для выявления герпесвирусной инфекции);
  • TORCH-профиль IgM (для выявления токсоплазмоза, краснухи, цитомегаловирусной инфекции, ВПГ 1 и ВПГ 2);
  • ВЭБ IgMTIgG (для выявления вирусной инфекции Эпштейн-Барр);
  • ВГС IgG (для выявления вирусного гепатита типа С).

Результат иммуноблоттинга может быть положительным (когда обнаружены антитела) и отрицательным (когда антитела в биологическом материале отсутствуют), а также неопределенным, ложноположительным и ложноотрицательным.

Где можно провериться на заражение вирусом, и что делать дальше

Каждая поликлиника, частная лаборатория, больница, клиника специализируется на подобном диагностическом мероприятии. Пройти тест можно в центре тестирования ВИЧ. Некоторые частные клиники предлагают услуги по консультированию и тестированию вируса СПИДа и ВИЧ на дому.

Рекомендуется провести один тест спустя 6 недель после предполагаемого заражения и спустя 12 недель. Пройти диагностику разрешается и в более поздний срок: на результат это не влияет.

ВАЖНО! После получения результатов исследования нужно обратиться к лечащему врачу для назначения соответствующей терапии.

Положительные пробы

Если результаты иммуноблота положительные, это еще не значит, что в организме развивается ВИЧ-инфекция. Для подтверждения диагноза назначают иные исследования, например, непрямую иммунофлюоросценцию.

Хоть метод иммуноблота и обладает высокой чувствительностью, однако, за счет определения иммуноглобулинов класса G возможен ложноположительный результат в первые 3 недели после инфицирования. В таком случае проводится тест повторно спустя определенное время.


Все причины получения ложноположительного результата неизвестны. Наиболее распространенными источниками выступают период беременности и недавнее введение вакцины иммунопрепарата. Если по истечении определенного времени после воздействия подобных факторов иммуноблот на ВИЧ  все так же положительный, это означает, что человек инфицирован.

Негативный результат

Иммуноблот может давать отрицательный результат, что сигнализирует об отсутствии в организме антител к ВИЧ-инфекции и, как следствие, – о полном здоровье.

Отрицательный иммуноблот часто наблюдается в «период окна» (в первые 3 месяца между инфицированием и появлением в крови антител). На протяжении данного срока тест не обнаруживает соответствующие антитела, но в иной жидкости (сперме, влагалищном отделяемом) можно выявить таковые и в большом объеме.

Как проводится анализ

Иммуноблот позволяет идентифицировать антитела путем исследования крови и применения гель-электрофореза.

В первую очередь проводится разрушение бактериальных клеток или вирионов ультразвуком, после чего путем электрофореза – разделение всех антигенов вируса или бактериальных клеток. В итоге получается коммерческий реагент, помещаемый на специальную нитроцеллюлозную пленку.

Во время постановки иммуноблоттинга на материал с известным антигеном наносят и исследуемую сыворотку. После того, как провели инкубацию и отмывание несвязавшихся антител, начинают иммуноферментный анализ, наносят на сыворотку иммуноглобулины, которую помечают ферментом, и хромогенный субстрат, меняющий цвет при контакте с ферментом.

Если имеются антитела, на носителе образуются пятна.


иммуноблот на вич
Для проведения иммуноблоттинга на ВИЧ используется забор крови

Линейный метод

Линейный блот на ВИЧ – непрямое иммунологическое исследование, методом которого получают качественный показатель аутоантител класса IgG.

В ходе иммунологического исследования используют вирусное вещество ВИЧ-формата или антигены. В лабораторных условиях соединяют белки ВИЧ и отдельные антитела, которые были получены из сыворотки крови. Далее проводится инкубация путем добавления меченых антител и человеческого иммуноглобулина.

Диагностика ВИЧ у новорожденных

В организме ребенка до 9 месяцев, рожденного от инфицированной женщины, присутствуют антитела к ВИЧ матери, что становится причиной получения ложноположительного результата ИФА. По этой причине предпочтение отдают вирусологическим тестам – количественному анализу РНК и ДНК ПЦР. Более чувствителен культуральный метод диагностики инфекции.

ВАЖНО! Показаниями к проведению диагностических мероприятий по выявлению ВИЧ-инфекции у новорожденных выступают: рождение от инфицированной женщины, получение сомнительного результата ранее осуществимого анализа.

Исследование при беременности

Так как ВИЧ-инфекция, развивающаяся у беременной женщины, может передаться будущему ребенку, требуется ранняя диагностика на вирус иммунодефицита.

В первую очередь проводится иммуноферментный анализ, применяемый в качестве скрининга. Диагностическое мероприятие помогает обнаружить в сыворотке крови антитела к инфекции. Несмотря на точные результаты анализа в период беременности, требуется повторное проведение исследования.

Разновидность ИФА – иммунный блоттинг, который часто используют в период беременности. По результатам диагностики можно выявить антитела к определенным антигенам, которые распределены по молекулярному весу методом электрофореза.

Как правильно пройти тест

Иммунный блоттинг на ВИЧ требует специальной подготовки, как и другие методы диагностики заболевания. Если провести некоторые исследования и получить результаты определенных показателей можно на протяжении всего дня (например, ответ на аллерген), то сдавать кровь на иммунологический анализ нужно только в утреннее время.

В предыдущий день перед диагностикой рекомендуется окончить повышенные физические нагрузки. Биологический материал сдают на голодный желудок. Как правило – это кровь с вены, которую в некоторых случаях забирают в несколько пробирок.

Расшифровка результатов

Расшифровку результатов иммуноблотта проводит лабораторный работник. Если обнаружили 2 из 3 протеинов ВИЧ-1 или ВИЧ-2, это указывает на присутствие в организме соответствующей инфекции. Исследование проводится для подтверждения положительного иммуноферментного анализа. Поэтому реакция проверяется и на такие протеины, как gp120/160, gp41 в сочетании с р24. Последние – это часть трех генов СПИДа – gag pol and env.

иммуноблоттинг на вич
Схематическое отображение результатов иммуноблоттинга на ВИЧ

Первичная диагностика предполагает исследование белков р25, gp110/120 и gp160, указывающих на раннюю стадию развития заболевания. При положительном результате, который дал второй серологический иммуноферментный анализ, проводится иммуноблот. Если и последний дал положительный результат, диагноз ВИЧ подтверждают.

Вероятность положительного результата зависит от периода, который прошел от момента инфицирования до проведения диагностики:

  • спустя 28 дней – 60-65%;
  • спустя 42 дня – 80%;
  • спустя 56 дней – 90%;
  • спустя 84 дня – 95%.

Ложноположительный результат возможен, если забор биологического материала для дальнейшей диагностики проводился в период беременности, при нарушении гормонального фона, продолжительном подавлении иммунной функции определенными препаратами, которые принимает человек.

Критерии оценки анализа

Результаты анализа ИФА и иммуноблоттинга должны соответствовать следующим критериям:

  • блот исследуемого биологического материала совпадает с блотом образца сравнения;
  • молекулярная масса основного выявленного компонента соответствует требованиям спецификации.
иммунный блоттинг на вич
Результаты полученные в специализированной лаборатории будут наиболее точными

Выявляемая примесь и ее содержание должны отвечать требованиям свидетельства на стандартный образец.

Неинтерпретируемые результаты

В некоторых случаях иммуноблоттинг на ВИЧ и СПИД не соответствует отрицательному и положительному результату, причем врач не может определить истинную причину сомнительных сведений. Часто причиной неправильной  интерпретации выступает инфицирование, вызванное другим серотипом.

Для устранения сомнений ПЦР и ИФА проводятся в динамике. При отсутствии характерной заболеванию симптоматики на протяжении полугода и факторов риска говорят о полном здоровье. На этом этапе диагностические мероприятия оканчивают.

Сомнительный результат также можно получить при развитии в организме иного инфекционного заболевания, ракового новообразования, аллергической реакции.

Важно! При сомнительном результате человек не может быть донором крови и другого биологического материала.

Источник: medsito.ru

Иммуноблоттинг – что это

Иммуноблоттинг – это методика лабораторных исследований сыворотки крови, позволяющая выявить наличие в крови специфических белковых соединений (антител).

Название метода происходит от английского Blot (пятно). В нашей медицине принят термин “блоттинг”. Поскольку метод относится к сложной теме из молекулярной биологии, подробно его рассматривать не будем. Остановимся только на моментах, которые необходимы для понимания диагностической цепочки.

Справочно. Основным в иммуноблоттинге является выделение необходимых белков из сыворотки крови, нанесение их на носитель с последующим анализом. Чтобы выделенные белки увидеть, их, например, окрашивают в какой-либо цвет (отсюда и пятно).

Метод диагностики иммуноблоттинг применяется для определения различных заболеваний. В диагностике ВИЧ он проявил себя эффективно.

Как проводится

Для проведения иммунного блоттинга используют электрофорез исследуемых белковых структур в полиакриламидном геле. После того, как произойдет разделение изучаемых антигенов по молекулярному весу, полученный материал переносят на нитроцеллюлозные или PVDF мембраны.
как проводится иммуноблоттинг
На мембране остается спектр белков, характерный для исследуемого заболевания. После этого на мембрану наносят сыворотку крови пациента. В случае, если сыворотка содержит необходимые антитела, происходит реакция связывания типа антиген-антитело.

Связывание происходит строго по соответствующим полоскам антигенов на мембране. За счет этого становится возможна визуализация образовавшихся комплексов антиген-антитело.

При положительном анализе иммунного блоттинга появляются видимые полосы на определенных участках мембраны.

Также многие современные методики исследования иммуноблоттинга проводятся при помощи ИФА (иммуноферментный анализ) или иммуноокрашивания.

Для каждого конкретного исследования применяют специфичные к исследуемому белку антитела. За счет этого иммунный блоттинг относится к высокоточным исследованиям с низким уровнем погрешности.

Справочно. Иммуноблоттинг на ВИЧ используется для выявления в крови антител к вирусу иммунодефицита человека.

В некоторых лабораториях вместо классического иммуноблоттинга применяют линейную методику, относящуюся к непрямым иммунологическим исследованиям, позволяющим провести качественную оценку наличия аутоантител класса IgG.

ИФА и иммуноблоттинг на ВИЧ

Иммуноферментный анализ (ИФА) относится к лабораторным иммунологическим методам качественной или количественной диагностики в анализе крови специфических соединений (низкомолекулярные соединения, макромолекулы, вирусы).

В основе иммуноферментного анализа лежит реакция антиген-антитело.

При выявлении в анализе указанного комплекса (антиген-антитело) его отмечают с помощью специального фермента.

Иммуноферментный анализ достаточно прост в использовании и отличается высокой точностью. В связи с этим, при диагностике инфекции его применяют в первую очередь.

Однако, согласно протоколам диагностики, такой серьезный диагноз на основании результатов одного ИФА не выставляется. Для подтверждения требуется обязательное проведение иммуноблоттинга на ВИЧ.

Справочно. Это связано с тем, что иммунный блоттинг отличается максимальной точностью. При получении нескольких положительных результатов иммуноблоттинга вероятность диагностической ошибки сводится к нулю.

Следует отметить, что в отличие от ИФА, иммунный блоттинг относится к сложным и весьма дорогостоящим методикам диагностики, поэтому он применяется только после получения 2 положительных анализов ИФА.

В отличие от ИФА, иммунный блоттинг не дает ложноположительных результатов при наличии у пациента антител к Эпштейн-Барр вирусу, ревматоидному фактору, главным комплексам гистосовместимости HLA, при беременности.

В каких случаях назначается анализ

Анализ на ВИЧ назначается:

  • при выявлении у пациента генитального герпеса, гонореи, сифилиса и других заболеваний, передающихся половым путем (ЗППП);
  • после незащищенного полового контакта с непроверенным партнером;
  • после нанесения татуировок или татуажа, выполнения пирсинга или проведения инъекционных косметологических процедур в нелицензированных заведениях;
  • после контактов с кровью инфицированного человека;
  • после использования игл, бритв, лезвий или хирургических инструментов, загрязненных биологическим материалом ВИЧ-инфицированного пациента;
  • при плановом обследовании перед получением гражданства, вида на жительство, при прохождении комиссии в военкомате, при прохождении профилактического осмотра перед поступлением в медицинский университет, при плановых профосмотрах (военные, хирурги);
  • при планировании беременности;
  • во время вынашивания ребенка;
  • при выявлении у пациента симптомов ВИЧ инфекции.

Симптомы ВИЧ на первых стадиях не специфичны. Заболевание может проявляться слабостью, постоянной сонливостью, вялостью, периодической лихорадкой, мышечными и суставными болями, хроническими тонзиллитами, увеличением лимфатических узлов, сыпью неясной этиологии.

В редких случаях возможны постоянные головные боли, частая потеря сознания, снижение памяти, развитие энцефалопатии.

Прогрессирует инфекция медленно, поэтому подобная неспецифическая симптоматика может наблюдаться на протяжении от 3 до 7 (и более) лет.

В дальнейшем симптомы проявляются в виде оппортунистических инфекций (сопутствующие инфекционные заболевания, развивающиеся на фоне снижения иммунитета из-за прогрессирующего ВИЧ).

Максимальная эффективность лечения достигается на стадии неспецифических проявлений. Поэтому, при наличии факторов риска заражения (инъекционная наркомания, частые незащищенные половые контакты с непроверенными половыми партнерами и т.д.) требуется регулярно проверяться на ВИЧ.

Иммуноблоттинг на ВИЧ – где сдать

Анализ на иммуноблоттинг можно пройти в центре СПИДа или частных лабораториях. По желанию пациента обследование может быть проведено анонимно.

Антитела к вирусу иммунодефицита человека появляются в крови зараженного человека уже через 2 недели после заражения.

Однако, для получения максимально точных результатов следует провести 2-3 теста на ВИЧ инфекцию. Чаще всего проводят обследование на 6 и 12 неделе после предполагаемого заражения.

Может быть проведено экстренное обследование (при возможности назначения ранней постконтактной профилактики).

Вероятность выявления положительного иммуноблоттинга на ВИЧ во многом зависит от времени, прошедшего от момента заражения.

Справочно. Через месяц после заражения анализ положителен у 60% пациентов, спустя 45 дней – у 80%, через 3 месяца антитела выявляются практически у 100% инфицированных.

В связи с этим, перед обследованием на ВИЧ требуется проконсультироваться с врачом СПИД-центра. Консультации проводятся анонимно. Специалист расскажет о том, как может передаваться вирус, как предохраняться от заражения, рассчитает срок, когда лучше пройти обследование и сколько раз необходимо сделать анализ.

Также по показаниям может быть назначена ранняя профилактика.

Результат иммуноблоттинга должен трактоваться исключительно специалистом. Самостоятельное назначение обследования в частном центре и расшифровка результатов «по интернету» может привести к диагностическим ошибкам и тяжелейшим последствиям для здоровья.

В СПИД-центре после анализа проводится послетестовая консультация. При выявлении положительного иммуноблоттинга врач назначает дополнительные обследования, на основании результатов которых пациенту подбирается комплексная антиретровирусная терапия.

Как проводится анализ на ВИЧ

Справочно. Согласно официальным протоколам диагностики ВИЧ-инфекции, в первую очередь проводится скрининговое исследование при помощи методики ИФА. Дальнейшая диагностика зависит от результатов первого исследования.

Если ИФА не выявил антител к ВИЧ и вирусных антигенов, обследуемому выдается отрицательный результат. Дальнейшее обследование не выполняется.

Исключение могут составлять случаи, при которых пациент не уверен в точных сроках предполагаемого инфицирования. Для уточнения может быть рекомендовано повторное прохождение теста через 6-12 недель (для исключения ложноотрицательных результатов).

При получении сомнительных или положительных результатов пациент получает направление на дальнейшее обследование в СПИД-центре. После этого проводится еще 1-2 анализа методом ИФА.
как проводится анализ на ВИЧ
При получении двух положительных или сомнительных результатов проводится иммуноблоттинг на ВИЧ инфекцию.

В дальнейшем врач назначает количественную ПЦР диагностику для определения активности вируса и вирусной нагрузки. Может быть назначена также вирусологическая диагностика, позволяющая идентифицировать тип вируса (ВИЧ1 или ВИЧ2).

Как подготовится к обследованию

Для исследования сыворотки на ВИЧ методом иммуноблоттинга используется венозная кровь.

Забор крови проводится натощак. За два дня до исследования рекомендовано исключить употребление спиртных напитков. Утром перед забором крови не рекомендовано курить.

Также за 1-2 дня до исследования рекомендовано исключить тяжелые физические нагрузки и стрессы.

Иммуноблоттинг – цена

Цена на исследование крови на ВИЧ методом ИФА начинается от 500-700 рублей (цена в частных лабораториях).

Иммуноблоттинг проводят преимущественно в СПИД-центрах по направлению иммунолога. Обследование в специализированных центрах проводится бесплатно.

Тесты для диагностики ВИЧ

Для диагностики ВИЧ существуют тест системы 3-го поколения (без антигенов) и 4-го поколения (с антигенами).

Тест системы первых двух поколений больше не производятся и считаются устаревшими.

На территории Российской Федерации используют только тест-системы четвертого поколения.

Старые тест системы уже не используются, поэтому при правильном прохождении обследования (двукратное ИФА и иммуноблоттинг) вероятность получения ложных результатом сводится к нулю.

Иммуноблоттинг – расшифровка результатов

При получении отрицательных результатов дальнейшее обследование не требуется. Отрицательные результаты говорят о том, что в крови пациента отсутствуют антитела к двум или трем специфическим гликопротеинам вирусной оболочки ВИЧ (GP41, 120 и 160).
белковый профиль
Пациентам с сомнительными результатами исследования рекомендовано повторное обследование через две недели или через 3, 6 и 12 месяцев. Срок повторного обследования определяются иммунологом из СПИД-центра.
интерпретация результатов иммуноблоттинга

Справочно. Получение положительного иммуноблоттинга на ВИЧ означает, что в крови пациента были обнаружены антитела к двум или трем специфическим гликопротеинам вирусной оболочки ВИЧ (GP41, 120 и 160).

Иммуноблоттинг при беременности

Справочно. Беременность может приводить к получению ложноположительных результатов ИФА. Такая ситуация наблюдается достаточно редко, однако, ее необходимо учитывать при трактовке результатов анализа.

В связи с этим, беременным при получении сомнительного или положительного анализа назначают повторный тест ИФА через 2-3 недели.

После этого, при получении повторного сомнительного или положительного результата, назначается иммунный блоттинг на ВИЧ.

При получении отрицательного иммунного блоттинга – ВИЧ исключается. При получении положительных результатов пациентке назначается дополнительное обследование (определение вирусной нагрузки, ПЦР, вирусологическая диагностика, определение уровня СD клеток).

В дальнейшем, в зависимости от сроков беременности и результатов дополнительного обследования назначается профилактика передачи вируса плоду. Вся профилактика назначается согласно протоколам ВААРТ.

Для профилактики заражения плода используются специальные препараты, разрешенные для лечения беременных.

У новорожденных, рожденных от матерей с ВИЧ, кровь исследуют методом ПЦР. Выбор метода связан с тем, что методы иммунного блоттинга и ИФА у таких детей не информативны до 18-ти месяцев жизни.

Методики иммунного блоттинга и ИФА у таких новорожденных могут давать ложноположительные результаты из-за выявления материнских антител.

Своевременно начатая профилактика уменьшает риск заражения ребенка. Поэтому для беременных крайне важна своевременная диагностика ВИЧ. В идеале обследование стоит пройти обоим половым партнерам еще на этапе планирования беременности.

Типичные ошибки при диагностике ВИЧ

Основная ошибка – это слишком раннее прохождение тестов (в период «серологического окна» когда в крови еще нет антител).

Внимание. Также к ошибкам относится самоназначение и обследование в частной лаборатории. Без иммунолога сложно подсчитать возможный период «серологического окна» и правильно трактовать результаты обследования.

Еще необходимо учитывать вероятность получения ложноположительных результатов ИФА у беременных и пациентов с вирусом Эпштейн-Барр.

Для исключения ошибок, обследование рекомендовано проходить в СПИД-центре под контролем иммунолога.

Источник: testanaliz.ru

Кроме ИФА в определенных случаях для тестирования ВИЧ-инфекции используют процедуру, называемую «иммуноблоттинг» или «иммунный блоттинг» (иногда называют еще «вестерн-блот»). По рекомендации ВОЗ иммуноблотинг используется при диагностике ВИЧ-инфекции в качестве дополнительного экспертного метода, который должен подтверждать результаты ИФА. Обычно этим методом перепроверяют положительный результат при ИФА, поскольку он считается более чувствительным и специфичным, хотя более сложным и дорогим. Но прежде чем подписать окончательный приговор пациенту, врач должен убедиться полностью в правильности диагноза. Поэтому вопрос о сложности и дороговизне здесь не может быть решающим.

Как по назначению, так и по способу исполнения к иммунному блоттингу хорошо подходит известное выражение «вывести на промокашку». Иммунный блоттинг сочетает в себе иммуноферментный анализ (ИФА) с предварительным электрофоретическим разделением белков вируса в геле и их переносом на нитроцеллюлозную мембрану («промокашку»). Процедура иммуноблота состоит из нескольких стадий (рис. 27). Сначала предварительно очищенный и разрушенный до составных компонентов ВИЧ подвергается электрофорезу, при этом все входящие в состав вируса антигены разделяются по молекулярному весу. Затем методом блоттинга (аналог выдавливания на «промокашку» избытка чернил) антигены переносят из геля на полоску нитроцеллюлозы или нейлонового фильтра, которые отныне содержат невидимый пока глазом спектр белков, характерный для ВИЧ. Далее на стрип наносится исследуемый материал (сыворотка, плазма крови пациента и т. п.), и если в пробе есть специфические антитела, то они связываются со строго соответствующими им полосками белков-антигенов. В результате последующих манипуляций (подобных ИФА) результат этого взаимодействия визуализируется — делается видимым. В конечном итоге наличие полос на определенных участках стрипа подтверждает присутствие в исследованной сыворотке антител к строго определенным антигенам ВИЧ.

Иммунный блоттинг чаще всего используют для подтверждения диагноза ВИЧ-инфекции. ВОЗ считает положительными сыворотки, в которых методом иммунного блотинга обнаруживаются антитела к каким-либо двум белкам оболочки ВИЧ. Согласно этим рекомендациям, при наличии реакции только с одним из белков оболочки (gp160, gp120, gp41) в сочетании или без реакции с другими белками результат считается сомнительным и рекомендуется повторное исследование с использованием набора другой серии или другой фирмы. Для подстраховки, если

Рис. 27. Для проведения иммуноблотинга на первом этапе белки, содержащиеся в сыворотке крови, разделяют в геле по их молекулярной массе и заряду с помощью электрического поля (методом электрофореза в геле). Затем на гель накладывают нитроцеллюлозную или нейлоновую мембрану и «промокают» (это и есть блоттинг). Это осуществляют в специальной камере, которая позволяет осуществить полный пернос материала из геля на мембрану. B результате та картина расположения белков, которая была на геле, воспроизводится на мембране (блот), с которой можно далее легко манипулировать. Первоначально мембрану обрабатывают антителами к искомому антигену, а после отмывки несвязанного материала добавляют радиоактивно меченный коньюгат, который специфически связывается с антителами (как в ИФА). Местоположение образующегося комплекса «антиген-антитело — меченый коньюгат» определяют с помощью авторадиографии с использованием рентгеновской пленки. После ее проявления становится ясным, есть ли антигены в крови или их нет и после этого результат остается сомнительным, рекомендуется последующее наблюдение в течение шести месяцев (исследования продолжаются через каждые три месяца).

B настоящее время в РФ для использования при диагностике ВИЧ-инфекции рекомендовано использовать пять тест-систем, среди которых имеются как российские, так и зарубежные.

Следующая глава >

Источник: med.wikireading.ru

Метод иммуноблоттинга (первоначальное название Western blot, WB1) был разработан главным образом в целях обнаружения в сыворотках пациентов антител, реагирующих с отдельными белками возбудителей инфекционных заболеваний, чаще всего вирусов.

Метод представляет собой следующее.

 

1. В культурах клеток in vitro (в настоящее время, как правило, в промышленных масштабах) выращивают препаративные количества реплицирующихся вирусов.

2. Клетки разрушают (ультразвуком или иначе), вирусную массу выделяют из культуральной смеси методами ультрацентрифугирования.

3. Вирусные частицы диссоциируют на отдельные белки детергентами и подвергают электрофорезу в геле. В результате каждый вирусный белок в соответствии со своей молекулярной массой и электрическим зарядом занимает определенную позицию в геле. Без применения красок и специальных проявляющих реагентов фракционированные электрофорезом белки в геле не видимы глазу.

1 Впервые блестящая методическая идея «блоттинга» (переноса на «промокашку»; blot по-английски — пятно на промокашке) пришла в голову и была реализована применительно к электрофоретическому анализу ДНК биохимиком E.M. Southern в 1975 г. Из уважения к автору коллеги-биохимики воспользовались лингвистической особенностью фамилии Southern (южный) и тот же метод, примененный к РНК, назвали Northern blot (северный), а к белкам — Western blot (западный).

4. В целях существенной экономии дорогостоящих реагентов в дальнейшем фракционированные белки из геля «промокают», перенося таким образом на плоский пористый материал — нитроцеллюлозу. В производственных масштабах перенос продуктов электрофоретического разделения в геле на нитроцеллюлозу осуществляют также электрофорезом.

5. Лист нитроцеллюлозы с перенесенными на нее электрофоретически разделенными белками вируса нарезают на тонкие полоскистрипы (strip), соответствующие по формату специальным выпускаемым промышленностью пластмассовым «корытцам», в которых стрипы обрабатывают испытуемыми сыворотками и проявляющими реагентами.

 

6. Стрип заливают испытуемой неразведенной и разведенной 1:10 (или подбирают иные разведения) сывороткой, инкубируют 1 ч или более, тщательно промывают фосфатным солевым буфером с детергентом (0,1% Tween-20), заливают раствором конъюгата антииммуноглобулиновых антител с ферментом (например, пероксидазой хрена), инкубируют 1 ч, тщательно промывают, вносят раствор субстрата (например, ортофенилендиамина с перекисью водорода), после чего наблюдают, не проявятся ли окрашенные полосы в зонах расположения фракционированных вирусных белков.

В случае, если у человека в крови нет противовирусных антител, стрип остается неокрашенным (имеет место лишь неспецифический легкий фон по всей площади стрипа). Это отрицательный результат. Если окрашенными оказываются все полосы вирусных белков, результат квалифицируют как положительный. Если окрашиваются не все, а 1-2 полосы, результат рассматривают как неопределенный.

Ложноотрицательные результаты в иммуноблоте крайне маловероятны. Поэтому по международным соглашениям сертифицированные для клинической диагностики промышленно выпускаемые иммуноблоттинговые тест-системы приняты в качестве подтверждающихпо отношению к планшетным и прочим скрининговым иммуноанализам. На рис. 4.11. представлена схема «сэндвича», приготовленного для блоттинга.

Метод иммуноблота Рис. 4.11.Схема «сэндвича», приготовленного для блоттинга

Источник: studopedia.ru


You May Also Like

About the Author: admind

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Этот сайт использует Akismet для борьбы со спамом. Узнайте, как обрабатываются ваши данные комментариев.